Fluo-8免洗細胞鈣流檢測試劑盒

1、細胞準備：
（1）正常培養基培養的細胞消化后，加培養基，細胞計數，取需要的細胞總數，離心。以下是按 96 孔板的建議用量，384 板需要的細胞數及體積，對應調整。96 孔培養板一般建議每孔細胞 20,000 左右。
（2）用 Hank’s 鹽溶液或類似無酚紅培養液，加胎牛血清至 1%濃度，用該培養液重新懸浮上述離心后的細胞。然后鋪細胞于培養板，每孔 50 uL。細胞培養 3-5 小時至貼壁或過夜。
2、染料裝載：
（1）取出緩沖液在室溫平衡 30 分鐘，顛倒混勻幾次。如果緩沖液注明是 10x 濃縮液，需要用去離子水稀釋成 1x 的工作緩沖液。
（2）取出 Fluo-8 試劑，室溫平衡 5-10 分鐘，離心將管內容物集中于管底。如果試劑不是一次性用完，可以對試劑進行分裝，分裝后的 Fluo-8 試劑繼續-20℃保存，減少凍融次數。注意避光。
（3）計算好需要的染料裝載液體積，按每孔 50 uL 計算。將 Fluo-8 試劑加于1x 的工作緩沖液，充分混勻。Fluo-8 試劑用量建議起始按 1:100 稀釋到工作緩沖液中，稀釋度可根據不同細胞株及需求調整。
（4）計算需要的儲存液體積，加入到上述 Fluo-8 工作緩沖液中，充分混勻，此為裝載液。
（5）吸去培養板孔中的培養液，將裝載液加到細胞培養板孔，每孔 50 uL。輕輕振搖10 秒鐘，加蓋，37℃ 培養 1 小時。
3、細胞內鈣流檢測：
（1）準備化合物及激動劑：激動劑建議不少于 6 個濃度梯度。每反應板設立未加激動劑或化合物的對照孔。激動劑/化合物板每孔 100-200 uL體積。
（2）準備與檢測儀配套的專用移液槍頭盒。
（3）準備檢測緩沖液：檢測緩沖液是加了的 Hank’s 鹽緩沖液。
（4）吸去培養板孔中的染料裝載液，每孔加檢測緩沖液 100 uL。
（5）設定好儀器檢測程序及各相關參數，檢測波長為 490/525nm，每 1-3 秒讀1 次，連續讀2 分鐘。
（6）在加激動劑/化合物前讀取一次基礎讀數。
（7）設定好化合物/激動劑板孔及槍頭與實驗細胞的對應位置。
（8） 啟動加激動劑/化合物的檢測程序，收集實驗數據。
（9）用（F-F0)/F0 *100%的方法或其它被驗證的方法進行數據處理分析。

未開封的緩沖液儲存于 4℃，使用前需要取出在室溫平衡 30 分鐘，顛倒混勻幾次。分裝的緩沖液或 1 x 工作液可儲存于室溫（22℃）1 周。Fluo-8 試劑儲存在-20℃ 或-80℃性能穩定1 年。