從零開始-細(xì)胞培養(yǎng)入門指南

細(xì)胞是生命的基本單位，是生物學(xué)研究中非常有用的工具。細(xì)胞培養(yǎng)的過程就是人工模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，置于無菌、適宜溫度及酸堿度的環(huán)境中，保證充足的營(yíng)養(yǎng)使其不斷生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能。作為基礎(chǔ)又常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技能，自然頗受關(guān)注。后續(xù)會(huì)創(chuàng)建《常見細(xì)胞培養(yǎng)攻略》系列，會(huì)為大家介紹一些常見細(xì)胞的培養(yǎng)方案，包括但不限于T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、干細(xì)胞培養(yǎng)等。今天主要是細(xì)胞培養(yǎng)入門指南的相關(guān)內(nèi)容，其他的內(nèi)容大家可以持續(xù)關(guān)注追更。

1. 細(xì)胞類型

1) 原代細(xì)胞(primary cell)：是指從機(jī)體的組織經(jīng)蛋白酶或其它的方法獲得單個(gè)細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞。一般認(rèn)為，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。

2) 細(xì)胞系(cell line)：原代細(xì)胞經(jīng)初次傳代成功后即為細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。其中能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系，不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系。

3) 細(xì)胞株(cell strain)：是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)細(xì)胞中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。

圖1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的步驟(General Procedure for Cell Culture)

2. 培養(yǎng)體系

1) 培養(yǎng)體系的選擇：主要分為含血清的經(jīng)典培養(yǎng)體系和無血清培養(yǎng)體系。簡(jiǎn)單、細(xì)胞種類、小規(guī)模選擇含血清培養(yǎng)體系；長(zhǎng)周期、強(qiáng)掌控、追求細(xì)胞質(zhì)量可選擇無血清培養(yǎng)體系。

表1 含血清和無血清培養(yǎng)體系的區(qū)別圖（圖片源于優(yōu)寧維）

2) 血清的選擇：分為胎牛血清、新生牛血清、小牛血清；其中胎牛血清的普適性較好。血清主要為細(xì)胞提供基本的營(yíng)養(yǎng)；血清中的微量元素可參與細(xì)胞的解毒代謝；血清中的抗蛋白酶成分也可以起到中和保護(hù)細(xì)胞的作用。小伙伴們想要了解更多血清信息，可以查看《細(xì)胞培養(yǎng)常見問題之血清篇》。當(dāng)然，具體細(xì)胞使用何種血清可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)驗(yàn)。

表2 不同血清的區(qū)別圖（圖片源于優(yōu)寧維）

3) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇：根據(jù)培養(yǎng)基的來源和組成成分，分為天然培養(yǎng)基（組織提取液）、合成培養(yǎng)基（經(jīng)典液體培養(yǎng)基如1640、DMEM等）、無血清培養(yǎng)基（如Lonza的X-VIXO系列培養(yǎng)基）。目前合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基使用居多。同樣，具體細(xì)胞使用何種培養(yǎng)基也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)組的經(jīng)驗(yàn)。

4) 抗生素：目前實(shí)驗(yàn)室會(huì)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加雙抗（青霉素-鏈霉素）或者三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）用來預(yù)防細(xì)胞污染，但是對(duì)于長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)并不建議持續(xù)使用抗生素，以防細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。

5) 培養(yǎng)基中酚紅的選擇：作為PH指示劑，酚紅是培養(yǎng)基的“?？?。酚紅為雌激素類似物，在進(jìn)行激素誘導(dǎo)或培養(yǎng)雌激素敏感的細(xì)胞時(shí)應(yīng)慎用，另外酚紅可能對(duì)下游的流式檢測(cè)分析帶來一定的干擾。

文中部分相關(guān)產(chǎn)品

3. 細(xì)胞來源

1) 從有資質(zhì)的公司直接進(jìn)行購(gòu)買：比如Absin可提供全面的原代細(xì)胞及優(yōu)化后適配的培養(yǎng)基，試劑和方案；ATCC作為全球quan威的生物資源中心之一，提供原代細(xì)胞、細(xì)胞系、微生物、重組物質(zhì)等。

2) 從生物體中提取制備：如血液樣本、實(shí)體組織樣本等。

3) 實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的凍存細(xì)胞復(fù)蘇獲得：細(xì)胞復(fù)蘇的步驟在基本操作里面，大家可以接著往下讀。

文中部分相關(guān)產(chǎn)品

4. 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)信息收集及物質(zhì)

所謂信息收集是指我們要在開始細(xì)胞培養(yǎng)前充分全面了解我們的細(xì)胞，大家可以參考文獻(xiàn)、ATCC的或者是實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，需要獲得的信息包括不限于以下幾個(gè)方面：

1) 細(xì)胞特性：細(xì)胞的形態(tài)、增殖速度、細(xì)胞周期、傳代頻率……

2) 生長(zhǎng)方式：貼壁or懸浮

3) 培養(yǎng)體系：含血清or無血清

4) 溫度：多數(shù)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是36-37℃；昆蟲細(xì)胞27℃

5) PH：多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是7.4，昆蟲細(xì)胞系6.2

6) CO2：多數(shù)適合5-7%CO2

5. 細(xì)胞培養(yǎng)基本原則

1) 無菌意識(shí)：使用無菌設(shè)備、試劑和耗材；使用個(gè)人防護(hù)裝備，避免污染；試劑如有需要可使用0.22μm的過濾器進(jìn)行無菌過濾；每次操作只處理一株細(xì)胞株，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，超凈臺(tái)以紫外燈照射 30 分鐘滅菌，以 70 % 乙醇擦拭無菌操作臺(tái)面；實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以 70 % 乙醇 擦拭無菌操作臺(tái)面。

2) 試劑分裝：培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑要養(yǎng)成分裝保存的習(xí)慣，不同的細(xì)胞即使適配的培養(yǎng)基配方相同也要另外配制分裝并做好標(biāo)記。

3) 及時(shí)保種：尤其是珍貴細(xì)胞，在細(xì)胞狀態(tài)良好的時(shí)候要及時(shí)凍存保種，以備不時(shí)之需。

6. 基本操作

1) 顯微鏡觀察：首先觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色（如果培養(yǎng)基中含有酚紅指示劑的話，當(dāng)培養(yǎng)液顏色變?yōu)辄S色就意味著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡），其次鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。如果細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)良好，且匯合度未達(dá)到傳代的要求，可視培養(yǎng)液顏色決定時(shí)候換液；若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，匯合度低，需要酌情優(yōu)化培養(yǎng)條件，排除污染情況；若細(xì)胞過于密集，則需進(jìn)行傳代操作。

細(xì)胞匯合是指細(xì)胞在培養(yǎng)皿中附著生長(zhǎng)的過程。匯合度是指細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿的百分比，不同類型的細(xì)胞需要達(dá)到不同匯合度后才能進(jìn)行傳代。

圖2 顯微鏡觀察細(xì)胞流程（圖片源于優(yōu)寧維）

2) 細(xì)胞復(fù)蘇

圖3 PBMC細(xì)胞復(fù)蘇流程圖
（PBMC Thawing Protocol: How to Optimize Cell Recovery）

a) 37℃水浴加熱需要使用的培養(yǎng)基；

b) 從液氮中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡量減少其暴露在室溫（15-25℃）的時(shí)間；

c) 在37℃水浴快速解凍細(xì)胞，將凍存管轉(zhuǎn)移到生物安全柜中，用70%乙醇或異丙醇擦拭凍存管外部；

d) 將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加入1mL培養(yǎng)基潤(rùn)洗凍存管，培養(yǎng)基同樣收集到50mL離心管中；

e) 向50mL離心管中補(bǔ)加15-20mL培養(yǎng)基，室溫300xg離心10分鐘；

f) 小心棄掉離心后的上清液，使用適量wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分裝到合適的培養(yǎng)皿/瓶中，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和狀態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3) 細(xì)胞傳代

圖4 細(xì)胞傳代流程圖
（Cell Plating, Media Change, and Culture Maintenance Protocol）

a) 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、匯合度以及是否污染，判斷是否進(jìn)行傳代處理；

b) 以25cm2培養(yǎng)瓶、貼壁細(xì)胞為例，棄掉培養(yǎng)基，使用無菌PBS洗滌細(xì)胞以去除抑制胰蛋白酶功能的血清；

c) 加入2ml胰酶，覆蓋細(xì)胞層，放入37℃ CO2培培養(yǎng)箱中孵育2min，期間可拿出觀察細(xì)胞消化脫落情況（注意：不同細(xì)胞使用的胰酶濃度及消化時(shí)間不同）；

d) 棄掉胰酶，加入2ml wan全培養(yǎng)基吹散細(xì)胞；

e) 顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度分裝到培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞置于 37oC, 5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4) 細(xì)胞凍存

圖5 分步凍存法流程圖

a) 在細(xì)胞密度達(dá)到107 cells/mL時(shí)可進(jìn)行凍存，采用分步冷凍法；

b) 懸浮細(xì)胞500 g室溫離心10 min收集細(xì)胞沉淀，貼壁細(xì)胞胰酶消化并終止后離心收集；

c) 棄上清，凍存液重懸細(xì)胞沉淀，1mL分裝并做好標(biāo)記；

d) 將凍存管放置-20℃ 1h；-80℃過夜；轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

文中部分相關(guān)產(chǎn)品

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...