雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒

        Firefly & Renilla Assay Kit（雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒）為檢測基因的表達量提供有效的手段，在 DLR檢測中，螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性可在單個樣品中依次檢測。先以螢光素（Luciferin）為底物來檢測螢火蟲螢光素酶的活性，然后加入抑制螢火蟲螢光素酶催化的物質，同時加入腔腸素（Coelenterazine）檢測海腎螢光素酶的活性，實現雙螢光素酶報告基因檢測。通過螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉錄調控元件或 5' 啟動子區(qū)克隆在 Luciferase 的上游，或把 3'-UTR 區(qū)克隆在 Luciferase 的下游，構建成報告基因（Reporter gene）質粒，然后轉染細胞，用適當藥物等處理細胞后裂解細胞，通過檢測螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉錄調控作用。海腎螢光素酶更多地被用作檢測轉染效率的內參，以消除細胞數量和轉染效率的差異。
        螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kD 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化螢光素生成氧化螢光素（Oxyluciferin），在螢光素被氧化的過程中，會產生光信號。海腎螢光素酶是一種分子量約為 36 kD 的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素氧化成腸酰胺（Coelenteramide），在腔腸素氧化的過程中也會產生光信號。本試劑盒的光信號可以通過化學發(fā)光儀、酶標儀或液閃測定儀進行測定。該試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無細胞內源活性干擾等特點。
產品特點：
快速：細胞裂解在10-15 min內完成。
方便：試劑易于配制，樣品檢測步驟簡單。
靈敏：能夠檢測10-20mol的螢光素酶。
酶的濃度線性范圍可達8個數量級。
產品組分：

1、細胞裂解
（1）將培養(yǎng)基移除，加 PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細胞可直接進行此操作，懸浮細胞需離心收集細胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer（用無菌水按 4: 1 稀釋組分 A），然后將培養(yǎng)板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min，充分裂解細胞。
注：裂解產物可室溫保存 6 h，-70℃可長期存放（裂解產物不能反復凍融）。
（2）將裂解產物 10000-15000 rpm 離心 3-5 min，離心后將上清液移入新的 EP 管中進行后續(xù)檢測。
注：細胞裂解后可立即檢測，也可以凍存，需要時再檢測。凍存樣品需融解至室溫再進行檢測。
2、工作液配制
（1）將所有組分恢復至室溫。
（2）用組分 B 充分溶解組分 C，配制成 0.2 mg/mL 的螢火蟲螢光素酶工作液。
注：螢火蟲螢光素酶工作液不能反復凍融，若單次實驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。
（3）用組分 D 將組分 E 稀釋成海腎螢光素酶工作液，稀釋方法為 1 ul E 組分加入到 49 µL D 組分中。
注：海腎螢光素酶工作液需現用現配。
3、化學發(fā)光值檢測
（1）按照儀器操作說明書開啟具有檢測化學發(fā)光功能的儀器，如多功能酶標儀，設定參數，測定時間為 10 s，測定間隔為2 s。
（2）每個樣品測定時，取樣品 20-100 ul（如果樣品量足夠，請加入 100 ul；如果樣品量不足可適當減少用量，但檢測孔用量需保持一致）。1×Lysis Buffer 為空白對照。
（3）加入 100 ul 螢火蟲螢光素酶檢測液，測定 RLU（relative light unit）值（建議酶標儀設置 Shaking 混勻功能）。
注：由于該發(fā)光為瞬時發(fā)光，建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后，立即進行檢測。
（4）加入 100 ul 海腎螢光素酶工作液，測定 RLU（relative light unit）值（建議酶標儀設置 Shaking 混勻功能）。
（5）在以海腎螢光素酶為內參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎螢光素酶測定得到的 RLU 值。根據得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內參，也可以進行類似計算。

-20℃保存。C 組分建議預先使用無菌水配置為 2 mg/mL 儲液，B 組分、D 組分及配置為儲液的 C 組分，
根據實驗需求進行小批量分裝。所有檢測工作液建議現配現用，避免反復凍融。

熒光素酶報告基因檢測試劑盒