Caspase 3/7 活性檢測試劑盒

在使用PBS的過程中要特別注意避免溶液被微生物污染。PBS在低溫情況下可能會產生沉淀。如果發現有沉淀產生，請置于37℃水浴至溶解后再使用。為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 準備工作：
a. 裂解液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
b. 檢測緩沖液溶解后混勻并置于冰浴上備用。
2. 測定pNA標準曲線：
a. 標準品稀釋液的配制：按照每0.9ml檢測緩沖液加入0.1ml裂解液的比例配制適量的標準品稀釋液。
b. 把試劑盒提供的pNA (10mM)用標準品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100和200μM，作為標準品。
c. 每個濃度取100μl用酶標儀進行檢測，或取適當量用容量不超過100μl的分光光度檢測杯進行檢測，測定A405。
d. 每一個標準品的A405減去不含pNA的空白對照的A405計算出實際的因pNA而導致的吸光度，并制作出pNA濃度相對于A405的標準曲線。
3. 樣品的收集：
a. 對于懸浮細胞：把沒有誘導凋亡的對照樣品和誘導凋亡的樣品，600g 4oC離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉步驟3d。
b. 對于貼壁細胞：吸取細胞培養液，備用。用消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養液中。600g 4oC離心5分鐘收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬細胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15分鐘。下轉步驟3d。
c. 對于組織樣品：按照每3-10mg組織加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉移到1.5ml離心管中，冰浴再裂解5分鐘。
d. 4oC 16,000-20,000g離心10-15分鐘。
e. 把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。
f. 立即測定caspase 3/7的酶活性或-80oC保存樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml，相當于每10微升待測樣品中至少含有10-30μg蛋白。如果細胞較少，可以適當增加細胞的用量。
4. Caspase 3/7酶活性的檢測：
a. 取出適量的Ac-DEVD-pNA (2mM)，置于冰浴上備用。
b. 如下設置反應體系：
注意：在設置反應體系時先加檢測緩沖液，再加待測樣品，適當混勻，注意避免在混勻時產生氣泡。隨后再加入10μl Ac-DEVD-pNA (2mM)。

c. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混勻，注意避免在混勻時產生氣泡。37oC孵育60-120分鐘。發現顏色變化比較明顯時即可測定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當延長孵育時間，甚至可以孵育過夜。
d. 樣品的A405扣除空白對照的A405，即為樣品中caspase 3/7催化產生的pNA產生的吸光度。通過同步驟1中獲得的標準曲線對比就可以計算出樣品中催化產生了多少量的pNA。
e. 參考Chemicon公司的caspase 3/7酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37oC under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當底物飽和時，在37oC一個小時內可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA產生1nmol pNA的caspase 3/7的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase 3/7。說明：在本試劑盒的檢測體系中，底物的起始濃度為0.2mM，此時底物是飽和的，對于許多樣品而言在37oC孵育2個小時以內底物都是飽和的；對于樣品中caspase 3/7酶活力特別高的情況，須用裂解液適當稀釋樣品后再進行測定。
f. 用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的DTT，不適合采用BCA法進行蛋白濃度測定)。這樣就可以計算出一個樣品單位重量蛋白中所含的caspase 3/7的酶活力單位。

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-20℃保存，Ac-DEVD-pNA和pNA需要避光保存。有效期12個月。