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                RNA到DNA的路程

                更新時間:2025-06-10      點擊次數:116

                一、RNA提取


                 1、樣本裂解:

                 組織樣本: Trizol用量:每 50-100 mg 組織加 1 mL Trizol,樣品體積不應超過 Trizol 體積的 10%。
                (1)將動物或植物組織切成小塊,在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。
                (2)將研磨好的組織粉末快速轉入裝有 1 mL Trizol 的 2 mL 離心管中,在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻,置于冰上, 待所有的樣品研磨完。
                (3)裂解產物應呈澄清的透明粘稠液體。對于富含蛋白、脂肪或多糖物質的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結節部位等,勻漿后仍會存留有不溶物質,可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min,然后吸取上清至一新的離心管中。

                 細胞樣本:
                (1)貼壁細胞:吸盡培養液,每 10 cm2培養面積(6 孔板單孔或 35 mm 平皿)加入 1 mL Trizol,用加樣器吹打數次,以確保細胞裂解,然后轉移至離心管中。 注:Trizol 的使用量應由培養皿表面 積決定,而非由細胞數目決定。Trizol 量不足可能導致提取的 RNA 中有 DNA 污染 。
                (2)懸浮細胞:離心收集細胞,吸盡液體,每 5-10×106動植物或酵母細胞,或每 1×107細菌細胞加入 1mL Trizol, 用加樣器吹打,使其裂解,然后轉移至離心管中。 注:添加 Trizol 前切勿洗滌細胞 ,以免 RNA 降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細菌或者酵母細胞 。

                2、液相分離:

                (1)裂解產物于室溫放置 5 min,使核酸-蛋白復合物分離。(注:此時樣品可在-80℃長期保存。 )
                (2)每 1 mL Trizol 加入 0.2 mL 氯仿,蓋緊管蓋,劇烈振蕩 15 s,室溫放置 2-3 min。
                (3)4℃ 12,000 x g 離心 15 min,樣品會分成三層:桔黃色的下層有機相,中間層和無色的上層水相。
                (4)吸取含總 RNA 的上層水相至一新的離心管中,吸取水相的體積為所用 Trizol 試劑的 60%。

                3、RNA 回收

                (1)按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 0.5 mL 異丙醇,顛倒數次混勻,室溫放置 10 min。
                (2) 4℃ 12,000 x g 離心 10 min,棄除上清,可見膠狀的 RNA 沉淀。
                (3)按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 1 mL 75%乙醇,顛倒數次混勻,洗滌沉淀。
                (4)4℃ 12,000 x g 離心 5 min,棄除上清。
                (5)室溫倒置 5-10 min 晾干或真空抽干(不要使用真空干燥離心機,以免 RNA 過干,難以溶解)。
                (6)加入適量(如 25uL) DEPC-ddH2O 或 TE 緩沖液,用加樣器吹打數次溶解 RNA。
                (7)通過 RNA 電泳以及紫外分光光度計檢測,確定 RNA 的濃度、純度和完整性。
                (8)所得的 RNA 應立即使用或適量分裝后-80℃保存,避免反復凍融。

                產品推薦:

                貨號

                產品名稱

                規格

                abs60154

                Trizol

                100mL/500mL

                abs9331

                Trizol(總RNA抽提試劑盒)

                1kit

                abs9259

                無酶無菌水

                500mL

                 

                二、逆轉錄


                1、去除RNA中基因組DNA殘留:

                組分

                體積

                RNA模板*

                ≤ 1 ug total RNA 或≤ 0.1 ug poly(A) mRNA

                5×gDNA remover buffer

                2 uL

                gDNA remover

                1 uL

                Nuclease-free Water (DEPC-treated)

                補足至10 uL


                混勻,并短暫離心,反應條件為37℃,5 min。
                * 采用自備的序列特異性引物時,RNA 模板的量可調整為“≤ 5 ug total RNA 或≤ 0.5 ug poly(A) mRNA"

                2、在上述的反應管中,直接添加如下的反轉錄反應所需組分,進行第一鏈cDNA 的合成步驟:

                組分

                體積

                gDNA remover 處理后RNA 樣品

                10 uL

                5 x Buffer (with primer)

                4 uL

                Enzyme mix

                1 uL

                Nuclease-free Water (DEPC-treated)

                補足至20 uL


                3、輕輕混勻,短暫離心;42℃孵育15-50 min。注意:復雜模板逆轉錄溫度可升高至50℃,提高反轉錄效率。
                反應時間可根據實驗應用場景做適當調整。如合成的cDNA 用作qPCR 模板,則反應條件為42℃孵育15 min。

                4、85℃加熱5 min 失活Enzyme mix。

                5、反應結束后所得的cDNA,請置于冰上進行后續實驗或冷凍保存。

                產品推薦:

                貨號

                產品名稱

                規格

                abs601510

                First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover

                50T/100T/200T

                 

                三、qPCR實驗


                染料法qPCR (以abs601511產品為例)

                用戶需自備的試劑:cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。

                請按照不同品牌熒光定量PCR儀的使用說明書要求進行實驗操作。

                操作示例:分別以20 µ l和50 µ l PCR反應體系為例:

                1、PCR 反應體系的建立:

                組分

                20uL體系

                50uL體系

                DNA模板

                1uL

                1uL

                正向引物(10uM)

                0.5uL

                1uL

                反向引物(10uM)

                0.5uL

                1uL

                2×RealStar Green Fast Mixture

                10uL

                25uL

                ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II

                0.4uL

                1uL

                RNase-free H2O

                補足至20uL

                補足至50uL


                注:
                *模板量: 10-100 ng基因組DNA,或 1-10 ng cDNA 為參照,因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數不同,可對模板進行梯度稀釋,以確定最佳的模板使用量。 另外, Two Step RT-PCR 反應的cDNA( RT 反應液)作為模板時的添加量不要超過 PCR 反應液總體積的10% 。
                *引物:通常引物濃度以 0.2 μM 可以得到較好結果,可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發生非特異性反應時,可降低引物濃度,由此優化反應體系。為了獲得理想的 qPCR 的效果,擴增片段的長度建議為 80-200 bp 。
                *不同儀器所需 ROX Reference Dye不同,或需要添加或不需要添加,請根據儀器說明進行操作。

                2、PCR 反應條件的設置: 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗體封閉的HotStart DNA聚合酶,如果在PCR反應 前進行模板的預變性,通常設定為95℃、2 min,復雜或高GC模板適當延長時間至5 min。該DNA聚合酶在15 s內可完成至 少300 bp的擴增,可以滿足絕大多數的qPCR實驗;對于超過350 bp或者高GC含量的擴增子,建議增加延伸時間至60 s或者采用三步法以提高擴增效率。

                兩步法 PCR 擴增標準程序:

                預變性

                95℃

                2min

                 

                40 Cycles 

                變性

                95℃

                15s

                退火/延伸

                60℃

                15-30s

                溶解曲線(儀器自動設置)



                三步法 PCR 擴增程序:

                預變性

                95℃

                2min

                 

                40 Cycles

                變性

                95℃

                15s

                退火

                60℃

                15-30s

                延伸

                72℃

                30s

                溶解曲線(儀器自動設置)


                注 : 以上舉例為常規 qPCR反應系統,僅供參考。實際反應條件因模板、引物等的結構不同而各異 , 需根據模板、引物、目的片段的特點設定最佳反應條件,并根據比例放大或縮小反應體系。

                3、在相應的 Real Time PCR 儀器上完成實驗,并分析結果。


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                貨號

                產品名稱

                規格

                應用

                abs601511

                2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系

                1.7mL×3

                染料法qPCR

                abs601512

                2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系(高濃度ROX)

                1.7mL×3

                染料法qPCR

                abs601513

                2×預混實時熒光定量快速PCR反應體系(低濃度ROX)

                1.7mL×3

                染料法qPCR

                abs60305

                探針法熒光定量PCR試劑盒

                100T/200T/500T

                探針法qPCR

                abs60307

                探針法超級多重熒光定量PCR試劑盒

                100T/200T/500T

                探針法qPCR


                耗材產品推薦:

                貨號

                產品名稱

                規格

                abs7089

                0.1mL PCR反應板(透明,半裙邊)

                1箱

                abs7090

                0.1mL PCR反應板(透明,無裙邊)

                1箱

                abs7091

                0.2mL PCR反應板(透明,半裙邊)

                1箱

                abs7092

                0.2mL PCR反應板(透明,無裙邊)

                1箱

                abs7246

                熒光定量PCR封板膜(壓敏強粘)

                1盒

                abs7247

                熒光定量PCR封板膜(24/48孔,壓敏)

                1盒

                abs7248

                PCR封板膜(強粘高透)

                1盒

                abs7093

                100uL PCR 8連管(帶蓋)

                1箱

                abs7094

                200uL PCR 8連管(帶蓋)

                1箱

                abs7119

                1.5mL離心管(無菌無酶)

                1箱

                abs7118

                0.5mL離心管(無菌無酶)

                1箱

                abs7071

                10uL濾芯吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7074

                200uL濾芯吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7077

                1000uL濾芯吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7176

                20uL濾芯吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7072

                10uL吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7073

                10uL吸頭(袋裝 無酶)

                1箱

                abs7075

                200uL吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7076

                200uL吸頭(袋裝 無酶)

                1箱

                abs7078

                1000uL加長吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7079

                1000uL吸頭(盒裝 無菌無酶)

                1箱

                abs7080

                1000uL吸頭(袋裝 無酶)

                1箱

                abs7081

                1000uL加長吸頭(袋裝 無酶)

                1箱


                 

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                Absin產品線:

                爆款產品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測);細胞培養(類器官試劑盒+基質膠,胎牛血清+培養添加劑+細胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...

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                愛必信(上海)生物科技有限公司

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