磷酸化蛋白WB沒結果？看完這篇文章再說

Wsetern Blot可以說是科研人的必修課，已經修煉的得心應手，但是遇到磷酸化蛋白的WB卻開始痛苦面具，一問一個不吱聲，接下來小愛帶大家深度剖析磷酸化蛋白的WB是怎么個事！

蛋白質磷酸化修飾：

是指在激酶的催化作用下，將ATP的磷酸根基團，轉移到蛋白的氨基酸側鏈上，這個過程一般是可逆的，可通過磷酸酶去除蛋白磷酸化修飾。蛋白的磷酸化修飾通常發生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸上。蛋白質磷酸化的修飾可以改變蛋白質的結構和活性，從而影響細胞的代謝、增殖、分化等生理過程，是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、很普遍，也是最重要的機制。目前涉及到的主要研究包括，疾病機制研究、細胞信號傳導研究、藥物研發、發育生物學、應激響應等。

蛋白磷酸化示意圖

為什么磷酸化蛋白的WB不好做？

1）磷酸化蛋白的豐度通常較低，大概只有總蛋白量的10%，甚至更低；

2）蛋白磷酸化修飾可逆，細胞一旦裂解，蛋白酶和磷酸酶會立即釋放，使磷酸化蛋白質可以在幾毫秒內去磷酸化。

磷酸化蛋白WB，慎之又慎

1、實驗前準備——充分了解自己的研究對象

一般通過查閱文獻或者借助數據庫了解研究蛋白的磷酸化位點及水平，這里推薦大家使用PhosphoSitePlus ——蛋白翻譯后修飾綜合性預測數據庫，只需輸入蛋白名稱，可以查詢該蛋白各種修飾類型，以及位點信息，以及其他的數據。對于表達水平較低的，可通過物理或化學方法進行一定的刺激和誘導。

PhosphoSitePlus數據庫

2、樣品處理，走好第一步

1）樣品要新鮮；

2）操作要迅速；

3）試劑器具要預冷，冰上操作；

4）盡量不要用超聲波細胞破碎儀處理細胞，組織研磨要提前用液氮預冷研缽；

5）裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，缺一不可；

6）注意有的磷酸化蛋白上能不要煮沸，否則會破壞其磷酸化位點；

7）測定濃度后，加入上樣buffer，分裝，凍存于-80度，避免反復凍融。

3、內參

需要設置兩個內參，一個是磷酸化蛋白對應的總蛋白，因為只檢測到磷酸化蛋白表達量的變化不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值變化了才能說明磷酸化水平的變化；另一個是普通內參，作為體系的對照。但是分孔上樣比較時誤差還是較大，常用的方法，是用一抗二抗去除液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內標。

CREB1磷酸化CREB1在模型大鼠PFC的表達

4、上樣，量要足

磷酸化蛋白和普通WB相比，磷酸化水平較低，所以上樣量要足。

5、封閉，看準再下手

牛奶中含有一種磷蛋白即酪蛋白，會引起高背景，在進行磷酸化蛋白檢測時建議使用牛血清白蛋白BSA或無蛋白的封閉劑。當然如果抗體上標注了建議，遵循建議也可以。

6、抗體孵育

因為磷酸化蛋白一抗最好4℃過夜孵育，保證抗體有充分的結合時間，4℃過夜，蛋白抗原不容易從膜上脫落。二抗則室溫1h即可。

7、洗滌，這種細節也有講究

建議初次實驗減小洗滌次數和搖床轉速，有背景總比孵不出來強，后期可以適當優化，得到比較理想的效果。

Pan B, Zhu X, Han B, Weng J, Wang Y, Liu Y. The SIK1/CRTC2/CREB1 and TWIST1/PI3K/Akt/GSK3β signaling pathways mediated by microRNA-25-3p are altered in the schizophrenic rat brain. Front Cell Neurosci. 2023 Jan 20;17:1087335. doi: 10.3389/fncel.2023.1087335. PMID: 36744005; PMCID: PMC9896578.

抗體618活動開始啦！！！

活動詳情：

1）凡購買愛必信最大規格抗體1支，即送贈品1個（可選），多買多贈！

2）下單需備注活動編碼AA22；

3）活動時間：6月1日-7月15日；

4）具體經銷商折扣，請單獨咨詢；

5）不與其他活動同享；

6）活動最終解釋權歸愛必信所有。

愛必信磷酸化抗體

磷酸化蛋白WB好物推薦

Absin產品線：
爆款產品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(類器官試劑盒+基質膠，胎牛血清+培養添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...