抗體/蛋白標(biāo)記常用熒光染料選擇指南

近年來，生物大分子標(biāo)記技術(shù)受到很大重視并取得了迅速進(jìn)展，此技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的檢測(cè)、核酸雜交測(cè)序以及疾病診斷等諸多方面。抗體/蛋白的標(biāo)記原理是標(biāo)記試劑與抗體/蛋白所帶的巰基、氨基及羧基等基團(tuán)發(fā)生置換或縮合反應(yīng)連接在一起。抗體標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域。本期小愛主要介紹3種常見的抗體標(biāo)記技術(shù)：熒光素（FITC、PE、APC等）標(biāo)記法、酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）標(biāo)記法和生物素（Biotin）標(biāo)記法。

抗體/蛋白的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記法

異硫氰酸熒光素 ( Flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 是在熒光素的結(jié)構(gòu)上引入異硫氰基( -N = C = S) 得到的，在堿性環(huán)境下，抗體的賴氨酸R氨基與FITC的硫碳胺鍵共價(jià)結(jié)合，形成牢固的抗體—FITC復(fù)合物（圖1），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的熒光標(biāo)記。

圖1 FITC標(biāo)記抗體原理

熒光試劑的種類不同，標(biāo)記方法各有差別，但所要求的條件和步驟大致相同。影響標(biāo)記的因素有溫度、MR 值及反應(yīng)液中熒光試劑和免疫球蛋白的比例[1]。常用標(biāo)記抗體的方法有攪拌法和透析法。方珍等[2]使用透析法對(duì)多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記方法如下：

（1）取1 mg 抗體蛋白溶液，用pH9.0的碳酸鹽緩沖液對(duì)抗體溶液進(jìn)行透析，使蛋白處于堿性環(huán)境。

（2）確定最佳反應(yīng)比值：按照FITC與蛋白含量比值分別為1:20、1: 10、3: 20 計(jì)算 FITC 用量，逐滴加 入溶于DMSO的 FITC，室溫避光反應(yīng) 4 h進(jìn)行 FITC 標(biāo)記。

（3）確定最佳標(biāo)記抗體反應(yīng)條件：確定FITC最佳用量后，按照反應(yīng)條件為4℃、2 h；20℃、4 h；37℃、 30 min進(jìn)行FITC標(biāo)記。

（4）反應(yīng)后液體用超濾離心管6 000 r/min 離心20 min，反復(fù)多次，收集每次離出液，測(cè)定熒光值 (F485/535)，直至離出液無熒光值。測(cè)定標(biāo)記后F485/535值，結(jié)合顯著性差異分析實(shí)際情況，得到最佳FITC與抗體含量比值和反應(yīng)條件。

抗體/蛋白的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記

HRP標(biāo)記抗體的原理其表面的糖分子被氧化成醛基，與抗體的氨基共價(jià)結(jié)合，形成HRP-抗體復(fù)合物。被HRP標(biāo)記的抗體在特定酶與底物下，顏色發(fā)生變化，通過對(duì)其顏色的深淺進(jìn)行抗原的定性、定量分析，被廣泛用于WB、ELISA、免疫組化等分析方法中。

制備辣根過氧化物酶( HRP) -抗體結(jié)合物的方法主要有戊二醛兩步法和過碘酸鈉法[3]。徐晶晶等[4]制備了兔源的M13KE多克隆抗體，將多克隆抗體經(jīng)飽和硫酸銨法和Protein G Resin層析柱純化后運(yùn)用過碘酸鈉法對(duì)其進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記。標(biāo)記方法如下：

（1）取4mg HRP溶于1 mL去離子水中。

（2）加入400 μL新制備的0.1 mol /L過碘酸鈉室溫振蕩20 min;

（3）將反應(yīng)物于醋酸鈉緩沖液(0.001 mol /L，pH 4.4)中透析過夜；

（4）加入6 mg IgG，用0.2 mol /L碳酸鈉緩沖液( pH 9.5)調(diào)節(jié)溶液pH至9. 0~9.5，立即加入 200 μL新制備的5 mg /mL NaBH4 ，于4℃作用2 h。

（5）標(biāo)記物純化：向制備好的酶結(jié)合物中緩慢滴加等體積的飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，4℃沉淀30 min；5000 r/min 離心15 min，沉淀用適量的PBS溶解并加入等體積的甘油，-20℃保存，備用。

抗體/蛋白的生物素（Biotin-NHS）標(biāo)記

生物素（D-Biotin），是一個(gè)分子量只有244.31Da的小分子，經(jīng)活化后（Biotin-NHS）可與蛋白/抗體等生物大分子的氨基結(jié)合，不僅可以很好地保持大分子的生物活性，而且與親和素結(jié)合使用時(shí)具有多級(jí)放大作用，使其廣泛應(yīng)用于微量抗原、抗體定性、定量檢測(cè)及定位觀察研究。

王雁云等[5]研究表明生物素標(biāo)記人免疫球蛋白IgG 重鏈應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤贡粯?biāo)記的生物素盡可能的多， 同時(shí)又避免過多的生物素造成空間位阻影響。該研究將生物素與人免疫球蛋白IgG 重鏈以各種不同的比例進(jìn)行反應(yīng)，然后與連接有抗人免疫球蛋白 IgG 重鏈抗體的微球顆粒反應(yīng)，來評(píng)估生物素與待標(biāo)記的人免疫球蛋白IgG重鏈反應(yīng)的效價(jià)。標(biāo)記方法如下：

（1） 取4 mg 純化的人免疫球蛋白 IgG 重鏈溶解于1 mL NaHCO3 (0.1 mol/L) 中；

（2）取5 mg生物素溶解于0.5 mL DMSO中，得到10 mg/mL 的生物素溶液；

（3）在已溶解有人免疫球蛋白 IgG 重鏈的溶液中，緩慢加入 100μL 已經(jīng)制備好的生物素 DMSO 溶液， 室溫下讓人免疫球蛋白IgG重鏈與生物素反應(yīng)1h，然后讓反應(yīng)物過Sephadex G柱終止反應(yīng)。

熒光素標(biāo)記的抗體可以用來做流式細(xì)胞術(shù)FACS、IF、活體成像等標(biāo)記示蹤類實(shí)驗(yàn)；酶類標(biāo)記的抗體可以直接和檢測(cè)底物反應(yīng)，用于ELISA、WB、IHC等實(shí)驗(yàn)；生物素標(biāo)記的抗體可以再同酶聯(lián)親和素或酶聯(lián)Anti-Biotin 抗體反應(yīng)，用于抗體的純化、測(cè)定微量抗原/抗體等。愛必信（上海）生物科技有限公司可以提供多種抗體產(chǎn)品以及抗體標(biāo)記染料，同時(shí)可以提供蛋白/抗體標(biāo)記服務(wù)，體系成熟，目前常規(guī)染料標(biāo)記周期1-2周。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳中舉,張燕玲,黃金瑛.熒光標(biāo)記生物大分子及其應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué).生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè), 2004, 27(6): 348-352.

[2]方珍,鞠文,秦亞楠等.大腸桿菌O157:H7異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體的制備及評(píng)價(jià)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, 39(1).

[3]孫凌霜,齊巖,王彬,等.鴨卵黃免疫球蛋白的提純及兔抗鴨IgY(H+L) HRP標(biāo)記抗體的制備[J].中國獸醫(yī)雜志, 2007(1):10-12.

[4]徐晶晶,李迪,曹永生,等.辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗絲狀噬菌體衣殼蛋白抗體的制備與初步應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī), 2013(3):3.

[5]王雁云,張陽德.生物素標(biāo)記人免疫球蛋白IgG重鏈的效果評(píng)估[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 22(12):3.

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