分子實驗之如何保證樣本核酸穩(wěn)定？

科研狗起早摸黑做了幾天分子克隆實驗，

本想著拖了好幾個星期的實驗終于要做完啦！瞬間覺得自己棒棒噠！

但是最后看實驗結(jié)果！！！ 原地裂開

排查實驗試劑，沒問題！

排查實驗操作，沒問題！

排查儀器，沒問題！

那么問題到底出在哪呢？

其實問題有可能出現(xiàn)在樣本保存與前處理步驟中哦。生物樣本中的核酸(DNA/RNA)會因為核酸酶、溫度、pH值、微生物、自身化學(xué)性質(zhì)等因素而發(fā)生被動或主動降解，從而導(dǎo)致分子實驗結(jié)果不盡人意。目前針對不同科研的需求，更多的樣本保存方式也相繼問世，小愛為大家匯總了各類樣本保存的步驟、注意事項、以及樣本保存耗材或保存液的推薦。

一、實驗樣本主要類型：

分子實驗中主要的樣本類型有：純核酸類、組織類、細(xì)胞類及環(huán)境類。不同樣本具有不同的保存方式以及操作注意事項。

圖1 常見的實驗樣本類型

表1 不同類型樣本核酸保存方法及穩(wěn)定性

二、實驗樣本前處理步驟及注意事項

1、組織樣本：

塊狀組織樣本短時間內(nèi)無法充分裂解，一般需要進(jìn)行樣本預(yù)處理。組織取材在組織離體30min內(nèi)完成，取樣的動作要盡量快速利索，將組織按任一方向切成黃豆粒大小。

組織DNA提取：新鮮組織樣本用生理鹽水清洗2次，即刻進(jìn)行實驗。如若不立即進(jìn)行實驗，可用液氮速凍，-80℃凍存。

組織RNA提取：將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理,快速轉(zhuǎn)入裝有1mL Trizol(abs60154)的2mL離心管中，立即進(jìn)行實驗。若后期再進(jìn)行實驗，盡量保存時將樣本浸入RNA樣品保存液(abs9268)后置4℃冰箱過夜（4℃過夜是必需的，這樣可使RNA樣品保存液滲入到組織中），然后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱。或者液氮研磨組織，加入Trizol，放入-80℃保存。

圖2 組織樣本RNA提取流程圖

2、細(xì)胞樣本：

DNA提取：細(xì)胞收集沉淀后，進(jìn)行液氮速凍，-80℃保存。

RNA提取：

1）貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，每10cm²培養(yǎng)面積加入1mL Trizol，用加樣器吹打數(shù)次，以確保細(xì)胞裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。注：貼壁細(xì)胞Trizol的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面積決定，而非由細(xì)胞數(shù)目決定。Trizol量不足可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染；
2）懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每5-10×10⁶動植物或酵母細(xì)胞，或每1×10⁷細(xì)菌細(xì)胞加入1mL Trizol，用加樣器吹打，使其裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。 注：添加Trizol前切勿洗滌細(xì)胞，以免RNA降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞。若后期再進(jìn)行RNA提取實驗，細(xì)胞用液氮速凍，-80℃凍存。

3、血液樣本：

采用含有抗凝劑的真空采血管保存即可。但采血管中的抗凝劑種類多樣，抗凝劑的種類也會直接影響后續(xù)檢測結(jié)果，面對這么多的采血管如何進(jìn)行選擇？我們建議使用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管，不建議使用肝素抗凝管（因肝素在后面的核酸提取過程中很難去除，且肝素對PCR反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用，因此不建議使用肝素抗凝管）。采集完血液，顛倒混勻備用。另外冰凍血液溶解過程中會有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶，因此在冰凍前加入Trizol，切勿直接凍存新鮮血液，保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4、血清/血漿樣本：

全血不加抗凝劑分離的上清是血清，加入抗凝劑分離的上清是血漿。取全血后，靜止1-2h，置于離心機(jī)3000rpm離心15min即可獲得血清或血漿。

三、樣本前處理利器—RNA樣品保存液(abs9268)

RNA樣品保存液是一種無毒的可直接使用的樣品儲存液，能使細(xì)胞內(nèi)的RNA與RNA酶分離，防止樣本中RNA表達(dá)譜發(fā)生變化。加入樣本保存液的樣本中RNA在室溫可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃標(biāo)本可以長期保存。在RNA樣品保存液中保存的標(biāo)本，反復(fù)凍融至室溫20次不影響RNA的質(zhì)量。

操作步驟：

1）計算保存液用量：根據(jù)要保存的各樣本的體積，計算出所需RNA樣品保存液用量；a：RNA樣品保存液的用量應(yīng)當(dāng)是組織體積的10倍(100mg組織約用1mL RNA樣品保存液)；b：離心收集2×10⁷細(xì)胞RNA樣品保存液的用量是1mL；
2）分裝：將RNA樣品保存液按需要量分裝入自備保存管中；
3）切片：快速將較大的組織切成厚度＜0.5cm的任意片狀，較小的組織直接取下，立即浸入RNA樣品保存液中；
4）保存：保存時先將樣本浸入RNA樣品保存液后置4℃冰箱過夜，然后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱或繼續(xù)轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱。

四、本期小愛產(chǎn)品推薦

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...