質粒提取小課堂，讓你學完不emo

質粒小科普

質粒(Plasmid)是廣泛存在于生物界中的環(huán)狀雙鏈DNA分子。目前在細菌、放線菌、真菌和不少動植物細胞中均發(fā)現有質粒的存在，其中細菌質粒是研究最深入、應用較廣泛的^[1]。因為質粒分子本身具有復制功能的遺傳結構，可攜帶一些遺傳信息，并且其自我復制能力和攜帶遺傳信息能力非常強大，經過基因表達后可使其宿主細胞表現相應的性狀，所以質粒常被用作基因載體，在分子生物學、生物化學與細胞生物學等學科中得到廣泛的應用^[2]。

圖1 大腸桿菌質粒分子結構示意圖

質粒提取方法及原理

質粒的提取是分子克隆中常用的一種技術，即去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒的過程。質粒的質量直接影響到基因操作的后續(xù)步驟，如轉化、酶切和序列分析等，因此獲得足夠量的質粒是質粒應用的重要一步。生物學實驗中質粒的獲取方式主要是通過在大腸桿菌中擴增，從而獲取大量的含有目的基因的載體質粒。其主要過程是對感受態(tài)細菌進行轉化，挑取克隆菌落，在LB培養(yǎng)基中搖菌進行擴增和質粒抽提^[3]。科研工作者已經開發(fā)出很多質粒抽提的方法，目前普遍采用的質粒提取方法主要有堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有機溶劑法等。堿裂解法提取質粒具有得率高，適用面廣、快速、純度高等特點，因此堿裂解法目前被廣泛采用。下面著重介紹堿裂解法提取質粒的原理。

圖2 質粒提取過程

堿裂解法提取質粒主要原理是利用共價閉合環(huán)狀質粒和線性染色質在拓撲學上的差異。利用NaOH和SDS溶液使細胞裂解，在堿性溶液中，線性的大分子量細菌染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結構遭破壞而發(fā)生變性，但由于質粒DNA分子量相對較小，且呈環(huán)狀超螺旋結構，即使在高堿性pH條件下，兩條互補鏈也不會充分分離。當加入中性緩沖液調和時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，而染色體DNA不能復性，它們之間交聯(lián)形成不溶性網狀結構，并與細胞碎片、蛋白質、SDS等結合沉淀下來。通過離心沉淀，細胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質等可被除去，而質粒DNA小分子量的RNA留在上清液中，混雜的RNA用RNaseA除去。一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質粒DNA。由于堿裂解法的眾多優(yōu)勢，市面上大多數的質粒抽提試劑盒基本采用的方法是堿裂解法。

質粒提取分類

大多數實驗室都會選擇基于堿裂解法的質粒提取試劑盒來提取質粒，根據不同的樣本量及獲取目標質粒的產量分為質粒小提、質粒中提、質粒大提。

1、質粒小提

質粒小提主要是對于1-5mL的菌液中質粒DNA進行小量提取，獲得的質粒用來進行常規(guī)的載體構建實驗。

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1、采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，粗提物通過過濾柱除去內毒素； 
2、離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。
3、特殊的去蛋白液配方，可以高效去除核酸酶。即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列、HB101也可以輕松去除。有效防止了質粒被核酸酶降解。
4、特別內毒素清除方法，清除內毒素效果一般小于<0.1EU/μg。

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2、質粒中提

質粒中提是在質粒小提的基礎上進一步去除菌液中的內毒素，獲得的質粒可以用于細胞轉染，常規(guī)需要菌液量為10-15mL。

3、質粒大提

質粒大提與中提方法相同，一次可對100-200mL菌液進行抽提，從而獲得大量質粒。

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1、高效提取中大量菌液質粒DNA，提取菌液量：5mL、10mL、20mL、50mL、100mL或以上；
2、提取質粒DNA純度高，可高效去除質粒中污染的內毒素，內毒素去除率可高達90%以上，有效提升質粒轉染實驗的成功率；
3、真空濃縮，大幅提升洗脫液中質粒DNA濃度，DNA濃度可達2ug/uL以上；
4、用于培養(yǎng)菌液樣本中質粒DNA的提取，提取后的質粒DNA可用于細胞轉染、酶切、PCR、測序、體外轉錄與翻譯、構建文庫等多種分子生物學實驗。

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質粒提取其實并不難，但是選擇符合我們實驗的質粒提取方法和試劑盒非常重要，因為又快又好地提取出符合下游實驗要求的質粒，無疑會對我們的實驗起到錦上添花的作用。

本期的分子小課堂就到這里啦，祝大家實驗順利，我們下期再見啦！

[1] Lars M?lbak, Tett A, Ussery D W, et al. The plasmid genome database.[J]. Microbiology, 2003, 149(Pt 11):3043-5. DOI:10.1099/mic.0.C0123-0.

[2] Diaz Ricci J C ,Hernández ME. Plasmid Effects on Escherichia coli Metabolism[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2000, 20(2):79-108. DOI:10.1080/07388550008984167.

[3] Li G , Liu J , Chen N, et al. A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth A new method to recover L-tyrosine from E. coli fermentation broth[J].Bioengineered, 2020, 11(1):1080-1083.DOI:10.1080/21655979.2020.1827893.

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