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                類器官crispr-cas9基因編輯及慢病毒轉染實驗方法

                更新時間:2023-08-25      點擊次數:859

                近幾年,類器官研究十分火熱,在信號通路機制,藥篩藥敏等研究中對類器官模型需求激增,其中利用crispr-cas9基因編輯技術對類器官進行敲低或敲減來造模是個不錯的實驗方法,今天小愛帶大家來了解crispr-cas9基因編輯技術及慢病毒轉染方法。

                crispr基因編輯技術中有三個最為重要的組成部分:crRNA、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA與Cas9蛋白形成復合物,sgRNA指引(crRNA/cas9)復合物靶向目的DNA區域定向切割DNA,從而達到基因編輯的目的。


                圖1 crispr-cas9基因編輯技術示意圖

                 

                crispr-cas9基因編輯技術大體上有三種技術路線:All in one質粒轉染法,病毒轉化法,RNP復合物導入法。病毒轉化法是將sgRNA、crRNA和表達cas9蛋白的序列整合進病毒中,再使用病毒感染細胞。相較于質粒轉染法,優點在于sgRNA、crRNA和表達cas9蛋白可以持續存在于細胞中,從而達到一個很高的基因編輯效果


                圖2 慢病毒轉染細胞示意圖

                 

                很多小伙伴對類器官轉染方法十分好奇,類器官慢病毒轉染和細胞轉染大同小異,主要有以下幾個問題需要注意:

                 

                1、類器官在進行慢病毒轉染時需不需要從基質膠里解離出來?

                考慮到病毒對于基質膠的穿透性及轉染效率,轉染時建議將類器官從基質膠中解離出來,用適當培養基重懸在孔板內進行。

                 

                2、類器官在進行慢病毒轉染時需不需要消化成單個細胞?

                類器官在進行慢病毒轉染時,消化成單個細胞來轉染效率比較高,建議消化成單個細胞進行感染。

                 

                3、類器官轉染慢病毒多長時間合適?

                轉染時間可根據實際實驗情況調整,通常是轉染12-36小時,可以借鑒細胞轉染時間。

                 

                4、類器官篩選時要不要消化成單個細胞?如果不需要消化,從膠里解離出來就行?還是在基質膠里就行?

                類器官篩選不需要消化成單個細胞,在基質膠里就可以篩選,大部分的藥物都可以穿透基質膠,作用到類器官上。

                 

                以下給大家整理了類器官轉染步驟:

                 

                1)收集類器官并消化成單個細胞后,按2×105/孔鋪到24孔板中(細胞密度可以自行摸索);
                2)用含有6μg/ml polybrene(polybrene的濃度可以自行摸索)的1ml新鮮類器官培養基替換原培養基,加入適量病毒懸液,37℃孵育;
                3)(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入1ml新鮮培養基以稀釋polybrene;
                4)繼續培養12-36小時后,如有少量細胞貼壁,可用槍頭輕柔吹打下來,混勻,將細胞培養基混懸液收集至離心管中(一般是6-8孔為一組)。300g 4℃ 富集離心5min后移去上清,添加1ml左右類器官傳代培養緩沖液(abs9730)轉移到1.5mlEP管,重新重懸離心;
                5)觀察收集到的組織體積,添加25倍組織體積的基質膠(abs9495)重懸混勻(金屬冰盒或冰上操作);
                6)以24孔細胞培養板為例,每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板(金屬冰盒或冰上操作),將鋪好的培養板放入37℃培養箱中10-15min成膠,添加500-750μl 類器官培養基(恢復室溫)進行培養;
                7)待類器官出現明顯增殖現象(一般需要2-3天),更換含有藥物的類器官培養基進行篩選(如嘌呤霉素等),沒有轉染成功的類器官將會裂解凋亡,從而篩出成功轉染的類器官;

                (* 圖源網絡,僅供學習參考用)

                 

                今天講解就到這了,大家如有實驗問題,歡迎公眾號后臺交流哦!


                貨號

                品名

                規格

                abs9495

                基質膠(低因子、無酚紅)

                1.5ml*4/ 1.5ml*8

                abs9730

                類器官傳代培養緩沖液

                250ml/ 250ml

                abs9444

                Organotial人肝癌類器官培養基試劑盒

                1kit

                abs9445

                Organotial人結直腸癌類器官培養基試劑盒

                1kit

                abs9443

                Organotial人肺癌類器官培養基試劑盒

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                abs9449

                Organotial人胃癌類器官培養基試劑盒

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                abs9447

                Organotial人胰腺癌類器官培養基試劑盒

                1kit

                abs9589

                Organotial人鼻咽癌類器官培養基試劑盒

                1kit

                abs9739

                Organotial人腦膠質瘤類器官培養基試劑盒

                1kit

                abs9446

                Organotial人乳腺癌類器官培養基試劑盒

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                abs9514

                Organotial小鼠正常腸類器官培養基試劑盒

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                abs9516

                Organotial小鼠正常肝類器官培養基試劑盒

                1kit

                abs9515

                Organotial小鼠正常肺類器官培養基試劑盒

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                abs9643

                Organotial小鼠正常胃類器官培養基試劑盒

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                abs9583

                Organotial豬子宮內膜類器官培養基試劑盒

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                abs9591

                Organotial奶牛乳腺類器官培養基試劑盒

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