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概述

DHA是一種半合成衍生物，是C15H22O?的主要活性代謝產(chǎn)物。本研究的目的是在體內(nèi)和體外模型中研究DHA對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的影響。體重、存活率、結(jié)腸長度和疾病活動指數(shù)評分用于評估結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。采用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素10、白細(xì)胞介素12和腫瘤壞死因子α的表達(dá)。western blot分析檢測Janus激酶2（JAK2）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的表達(dá)，以及JAK2（p-JAK2）和STAT3（p-STAT3）的磷酸化。westernblot分析和免疫組化檢測緊密連接蛋白的表達(dá)。

此篇文章發(fā)現(xiàn)右旋糖酐硫酸鈉（DSS）+DHA組小鼠的體重和結(jié)腸長度分別顯著低于DSS組和長于DSS組。與DSS組相比，DSS+DHA和DSS+5-氨基水楊酸（5-ASA）組中IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的表達(dá)降低，而IL-4和IL-10的表達(dá)顯著上調(diào)。DHA顯著增加閉塞帶-1和閉塞素的表達(dá)。Western blot分析和/或免疫組織化學(xué)染色分析表明，DSS+DHA和DSS+5-ASA組中JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)顯著低于DSS組。DHA對UC有特殊的治療作用。DHA的抗炎機(jī)制與阻斷JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為DHA可能是一種有用的藥物提供了證據(jù)，并有望成為治療人類UC的一種有希望的新療法。

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研究背景

炎癥性腸病（IBD）是一種以慢性和復(fù)發(fā)性炎癥為特征的免疫介導(dǎo)疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩病，癥狀為腹痛、腹瀉、大便出血和體重減輕。其發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)不斷上升。其中UC以粘膜炎癥復(fù)發(fā)為特征，病變主要位于直腸和近端結(jié)腸。目前UC的治療干預(yù)主要集中在誘導(dǎo)和維持臨床緩解。IBD的確切病因尚不清楚。，腸道細(xì)菌、生活習(xí)慣和遺傳因素都會導(dǎo)致疾病的發(fā)展。目前用于治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸（ASA）、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制品。由于療程較長，他們的治療通常受到不良事件的限制。當(dāng)停止治療時(shí)，疾病經(jīng)常復(fù)發(fā)。此外，這些藥物并非對所有患者都有效。這種疾病需要新的更有效的治療方法。

雙氫C15H22O?（DHA）是一種半合成衍生物，是C15H22O?的主要活性代謝產(chǎn)物，C15H22O?是從中草藥青蒿中分離出來的天然產(chǎn)物。DHA是*且耐受性良好的藥物，具有療效高、副作用低、成本低等優(yōu)點(diǎn)。DHA是C15H22O?家族的衍生物，也是世界衛(wèi)生組織推薦的一線抗瘧藥物之一。DHA已被證明具有抗病毒和抗菌作用，也是一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑。

DHA具有抗炎和抗腫瘤功能。先前的一份報(bào)告表明，DHA通過調(diào)節(jié)激活I(lǐng)BD進(jìn)展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）和核因子κB（NF-κB）信號通路，抑制黑色素瘤細(xì)胞、食管癌細(xì)胞和其他惡性腫瘤細(xì)胞的生長。

在本研究中，我們假設(shè)DHA可能通過類似的機(jī)制抑制UC的進(jìn)展[10]。雖然已經(jīng)應(yīng)用了一些治療方法來控制IBD的發(fā)展，但一些IBD患者仍可能發(fā)展為結(jié)直腸癌。IBD目前被認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，如果不能有效治療，可能會發(fā)展為結(jié)腸癌。由于IBD的治療需要長期藥物治療，DHA可能是治療UC的一種有希望的候選藥物。在此，我們研究了DHA對右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的UC體內(nèi)模型的影響，并探討了其潛在機(jī)制，其中涉及Janus激酶2（JAK2）/STAT3信號通路。

實(shí)驗(yàn)過程

1. 小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的建立

2. 結(jié)腸的組織學(xué)分析

3. 細(xì)胞培養(yǎng)

4. 細(xì)胞活力測定

5. Annexin V染色

6. ELISA檢測

7. 免疫組化染色

8. 蛋白質(zhì)印跡分析

9. RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR

10. 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.DHA改善DSS誘導(dǎo)的體內(nèi)結(jié)腸炎

為了闡明DHA在慢性結(jié)腸炎中的作用，我們觀察了DHA對DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎的影響（圖1A）。與DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠相比，用DHA和5-ASA治療的小鼠顯示出顯著減少的炎癥反應(yīng)。DSS組小鼠的體重顯著低于對照組。但是20只老鼠的體重?mg/kg DHA和10?mg/kg 5-ASA組顯著高于DSS組（圖1B）。DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎可使小鼠結(jié)腸縮短。DAI是評價(jià)疾病活動性的重要指標(biāo)。根據(jù)從體重減輕、腹瀉和血便百分比中獲得的DAI，DSS組的DAI顯著高于對照組，而DSS+DHA組和DSS+5-ASA組的DAI低于DSS組（圖1C）。DSS組的結(jié)腸長度明顯短于對照組。DSS+DHA組和DSS+5-ASA組的結(jié)腸縮短顯著減少（圖1D，E）。

圖1.DHA對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎臨床癥狀的影響?

（A）DSS誘導(dǎo)小鼠慢性結(jié)腸炎的動物模型。（B）體重變化。（C）DAI評分計(jì)算為第51天體重減輕評分、腹瀉評分和糞便血評分的平均值。（D）UC模型中收集的冒號。（E）四組結(jié)腸長度的差異。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示與對照組相比，P<0.001與DSS組相比，P<0.01，P<0.001。N?=?10

未經(jīng)治療的結(jié)腸炎動物結(jié)腸切片的組織學(xué)評估表明，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的特征是粘膜結(jié)構(gòu)喪失、結(jié)腸壁增厚、潰瘍形成和結(jié)腸粘膜廣泛的炎性細(xì)胞浸潤（圖2A）。DHA和5-ASA治療可抑制這些病理癥狀和組織的逐漸恢復(fù)，減少粘膜和粘膜下層的炎性細(xì)胞浸潤，并保持結(jié)腸粘膜的完整性（圖2A）。未經(jīng)治療的結(jié)腸炎小鼠用肉眼觀察到局部結(jié)腸粘膜潰瘍、充血和水腫，而經(jīng)DHA和5-ASA治療的結(jié)腸炎小鼠的這些癥狀有所改善（圖2A）。此外，DSS+DHA組和DSS+5-ASA組的組織學(xué)評分顯著低于DSS組（圖2B）。總的來說，這些結(jié)果為DHA在小鼠UC治療中的保護(hù)作用提供了第一個證據(jù)。

圖2.DHA對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎結(jié)腸的影響?

（A）不同組結(jié)腸切片的代表性H&E染色圖像。比例尺：200?μm.（B）不同組的組織學(xué)評分。（C）四組小鼠結(jié)腸切片中JAK2的免疫組織化學(xué)染色。（D）四組小鼠結(jié)腸切片的免疫組織化學(xué)ZO-1染色。（E）臨床IBD患者結(jié)腸活檢中ZO-1和JAK2的免疫組織化學(xué)染色。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示與對照組相比，P<0.01與DSS組相比，P<0.05，P<0.01。N?=?5.

2.DHA增加腸緊密連接蛋白和ZO-1的蛋白表達(dá)

緊密連接蛋白中閉塞素和ZO-1的表達(dá)與IBD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[32]。為了研究DHA是否能修復(fù)慢性結(jié)腸炎小鼠腸道中受損的緊密連接蛋白，采用western blot分析檢測閉塞素和ZO-1的表達(dá)。如圖3A所示，DSS組中閉塞素和ZO-1的蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組。與DSS組相比，DHA組和5-ASA組的閉塞素和ZO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增加（圖3C，D）。逆轉(zhuǎn)錄（RT）-qPCR（圖3B）和免疫組織化學(xué)染色（圖2D）結(jié)果表明，DSS+DHA和DSS+5-ASA組的ZO-1表達(dá)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上均強(qiáng)于DSS組。為了驗(yàn)證免疫組化結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們選擇了一名臨床IBD患者的腸組織進(jìn)行ZO-1免疫組化染色，并獲得了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，DHA增加了慢性結(jié)腸炎小鼠腸道緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的蛋白表達(dá)。

圖3.DHA對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白的影響

（A）ZO-1和閉塞蛋白表達(dá)的Western blot分析。（B）四組小鼠結(jié)腸組織勻漿中ZO-1mRNA的相對表達(dá)。（C，D）ZO-1和閉塞蛋白的定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示與對照組相比，P<0.01與DSS組相比，P<0.01。

3.DHA保護(hù)與THP-1細(xì)胞共同培養(yǎng)的炎癥模型中Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞活力

為了探討DHA是否對炎癥環(huán)境中的腸粘膜具有保護(hù)作用，我們建立了一個在穩(wěn)態(tài)或炎癥狀態(tài)下腸內(nèi)分化的Caco-2細(xì)胞和分化的THP-1細(xì)胞的體外共培養(yǎng)模型。CCK-8檢測結(jié)果顯示，Caco-2細(xì)胞的活力在20或40%之間?µM DHA組高于模型組（圖4C）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，20、40周齡組Caco-2細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組?µM DHA組與模型組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A，B）。DHA處理的Caco-2細(xì)胞的存活率高于模型組，表明DHA對體外模擬的腸粘膜具有保護(hù)作用。然而，在20個細(xì)胞中，Caco-2細(xì)胞的生存能力?µM DHA組高于40%組?µM DHA組，表明20?µM DHA保護(hù)的Caco-2細(xì)胞模型比40μM DHA更有效地模擬腸粘膜?µM DHA。

圖4.DHA對體外共培養(yǎng)模型的影響?

（A，B）四組體外共培養(yǎng)炎癥模型中Caco-2細(xì)胞的凋亡率。（C）四組體外共培養(yǎng)炎癥模型中Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞活力。（D-I）四組體外共培養(yǎng)炎癥模型基底外側(cè)側(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α的水平。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示與對照組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001#與模型組比較，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

4.在體外共培養(yǎng)炎癥模型中，DHA抑制THP-1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和IL-17，并促進(jìn)IL-4和IL-10的產(chǎn)生

為了探討DHA是否減少Caco-2細(xì)胞和THP-1細(xì)胞體外共培養(yǎng)模型中模擬的炎癥反應(yīng)，使用ELISA試劑盒測定了在體外炎癥模型中共培養(yǎng)的基底外側(cè)側(cè)巨噬細(xì)胞（分化的THP-1細(xì)胞）產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-17、IL-4、IL-10和TNF-α的情況。DHA（20或40?µM）預(yù)處理減少了IL-lβ、IL-6和IL-17的產(chǎn)生（圖4D、F、H），而DHA增加了IL-4和IL-10的產(chǎn)生（圖4E、G）。有趣的是，在每個實(shí)驗(yàn)組的共同培養(yǎng)炎癥模型的基底外側(cè)，TNF-α水平?jīng)]有顯著差異（圖4I）。這些結(jié)果表明，DHA增加了體外共培養(yǎng)炎癥模型中抗炎細(xì)胞因子的水平，降低了促炎細(xì)胞因子的水平，表明DHA可以降低體外共培養(yǎng)炎癥模型中的炎癥反應(yīng)。

5.DHA對細(xì)胞因子表達(dá)的影響

為了驗(yàn)證DHA對DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)的影響，我們通過ELISA和RT-qPCR測定了細(xì)胞因子的表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示，DSS組中的IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α水平高于對照組，但DHA處理后顯著降低（圖5A、C、E、F）。DSS+DHA組的IL-4和IL-10水平顯著低于對照組，但高于DSS組（圖5B，D）。RT-qPCR結(jié)果顯示，DHA和5-ASA組中IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α的mRNA水平顯著高于對照組，但低于DSS組（圖5G、H、J）。另一方面，與DSS組相比，DHA處理顯著刺激IL-10 mRNA的表達(dá)（圖5I）。這些結(jié)果表明，DHA抑制UC促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)。

圖5.DHA對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和表達(dá)的影響?

（A–F）四組小鼠外周血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α的濃度。（G–J）四組小鼠結(jié)腸組織勻漿中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-αmRNA的相對表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示*與對照組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001與DSS組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。.

6.DHA對DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎中JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6A、B、E所示，與DSS組相比，DHA顯著降低JAK2和STAT3的表達(dá)。此外，我們對JAK2進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，并獲得了類似的結(jié)果（圖2C）。為了驗(yàn)證免疫組化結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們選擇臨床IBD患者的腸組織進(jìn)行JAK2免疫組化染色（圖2E），并獲得與DSS組相似的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠治療后，p-JAK2/JAK2比率降低（圖6D）。然而，DSS組小鼠結(jié)腸粘膜中磷酸化JAK2（圖6C）和磷酸化STAT3（圖6F）的水平上調(diào)，這與對照組、DSS+DHA組和DSS+5-ASA組相反。p-JAK2/JAK2（圖6D）和p-STAT3/STAT3（圖6G）的比率反映了p-JAK2和p-STAT3的水平，表明DHA抑制了JAK2和STAT3的磷酸化。

圖6.DHA對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的影響

（A）AK2、p-JAK3、STAT3和p-STAT3蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。（B）JAK2蛋白的定量分析。（C）p-JAK2蛋白的定量分析。（D）p-JAK2/JAK2的比值。（E）STAT3蛋白的定量分析。（F） p-STAT3蛋白的定量分析。（G） p-STAT3/STAT3的比率。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示與對照組相比，P<0.05，P<0.01與DSS組相比，P<0.05，P<0.01。

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