WB專欄——好的樣本制備是實驗成功的一半

一、蛋白提取 

樣本制備是WB實驗的第一步也是最重要的一步，它的操作雖然并不復(fù)雜，卻有很多需要注意的細(xì)節(jié)。

根據(jù)實驗需要的目標(biāo)蛋白的不同，大致可以分為三種：總蛋白、膜蛋白和核蛋白。總蛋白提取顧名思義就是把組織或細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白全都提取出來；膜蛋白、核蛋白提取簡單來說就是把細(xì)胞膜、細(xì)胞核上的蛋白質(zhì)提取出來。

提取流程概覽

不同部位的蛋白要能夠提取分離，需要用到不同的提取試劑，看起來十分麻煩，愛必信的蛋白抽提試劑盒（abs9346）提供了一種比較簡單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白的分離。

二、常見問題&解決策略

Q1 蛋白信號弱甚至無信號

在應(yīng)用裂解液進(jìn)行裂解的時候，除了釋放出目標(biāo)蛋白，也同時釋放出一些酶，這些酶可能會降解我們的目標(biāo)蛋白，所以需要對這部分酶進(jìn)行降解。

添加合適的蛋白酶抑制劑（abs9161）或磷酸酶抑制劑（abs9162），全程低溫操作，提前預(yù)冷PBS（abs961）、裂解液甚至槍頭等，從收集細(xì)胞開始一直到煮樣的全過程都應(yīng)該盡可能的保持在冰上操作。

蛋白酶/磷酸酶抑制劑推薦

如果實驗過程中需要這部分酶和一些小分子蛋白，在選擇裂解液的時候也要選擇沒有抑制劑的裂解液（abs9231和abs9239）

樣品中不含待測蛋白，有太多可能性，對蛋白定位不準(zhǔn)確，采用了錯誤的提取方法。

找準(zhǔn)蛋白定位，是否需要保留蛋白的天然結(jié)構(gòu)，如果需要的話在選擇裂解液的時候要選擇不含去垢劑或者含少量Triton-X-100的裂解液（abs9230）；不需要的話可能是RIPA試劑的濃度沒有調(diào)配好，或者選擇了不合適強(qiáng)度的RIPA。

常規(guī)裂解液對比表

如果您覺得裂解液的選擇太麻煩，愛必信為您精心準(zhǔn)備了免疫印跡及免疫沉淀用裂解液（abs9116，abs9239），這兩款產(chǎn)品的濃度是經(jīng)過大量的實驗驗證調(diào)配出的最佳濃度，幾乎適用于90%的樣本制備，讓您的樣本制作更輕松。

裂解液推薦

* 樣品蛋白含量低

* 去除高豐度蛋白，富集低豐度目的蛋白

Q2、蛋白成坨吸不上來，電泳條帶形狀不好

SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高

①再煮5min。常規(guī)煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；
②如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮；
③也可以對樣品進(jìn)行超聲。

煮樣不能過久，容易造成蛋白凝固，出現(xiàn)沉淀和水分離，只能丟棄。

Q3、出現(xiàn)多帶現(xiàn)象

* 細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)不同    
* 使用原始未傳代的細(xì)胞株，做對照實驗
* 蛋白具有多種修飾形式，可能存在糖基化、磷酸化、羥基化
* 去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾
* 蛋白樣本降解        
* 加抑制劑、冰上操作

蛋白樣品的制備是整個WB實驗最初的一步也是最關(guān)鍵的一步，選對試劑找對方法至關(guān)重要，愛必信將不斷探索與開發(fā)優(yōu)良的試劑，為您的實驗保駕護(hù)航。