大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外 CFSE 染色標(biāo)記的實(shí)驗研究

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種位于骨髓微環(huán)境、具有多 向分化潛能的成體干細(xì)胞。因其取材方便簡單、能 在體外大量擴(kuò)增、可自體移植避免免疫排斥和倫理 問題，已成為理想的組織工程種子細(xì)胞和基因治療 的靶細(xì)胞。文獻(xiàn)報道，MSCs 移植可用于治療正 己烷中毒導(dǎo)致的周圍神經(jīng)。BMSCs 如應(yīng)用于 組織工程和基因治療，首先需要解決的問題之一是 如何高效、安全地標(biāo)記 BMSCs，進(jìn)而跟蹤其在體內(nèi) 的歸巢、分化、存活等系列過程。

羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5，6 － carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是 一種可穿過細(xì)胞膜、與細(xì)胞內(nèi)氨基不可逆結(jié)合的熒 光染料，因其標(biāo)記效率高、容易檢測、無放射性而逐 漸得到廣泛應(yīng)用。本研究將 CFSE 用于 BMSCs 的體外標(biāo)記，并探討其最佳標(biāo)記濃度和最佳標(biāo)記時 間，旨在探索建立體外 BMSCs 的 CFSE 標(biāo)記方法，為 BMSCs 的移植研究提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

BMSCs 的 CFSE 標(biāo)記

熒光顯微鏡下觀察可見，標(biāo)記 CFSE 的 BMSCs 細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都發(fā)出綠色熒光，整個細(xì)胞 呈綠色，細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度最高。CFSE 標(biāo)記的 BMSCs 仍保持良好的細(xì)胞形態(tài)，呈梭形或多角形。BMSCs 標(biāo)記 CFSE 后進(jìn)行 Hochest 33342 染 色，以計算 CFSE 標(biāo)記率，結(jié)果顯示:CFSE 濃度為 2． 5 μmol /L、標(biāo)記時間為 20 min 及以上時，標(biāo)記率 基本為 100 % ;5 μmol /L 或 10 μmol /L 的 CFSE 標(biāo) 記 15 min，細(xì)胞標(biāo)記率即基本為 100 % ;CFSE 濃度 為 20 μmol /L 時，僅標(biāo)記 5 min 就能使細(xì)胞幾乎 100% 標(biāo)記;CFSE 濃度 ＞ 10 μmol /L，作用時間 ＞ 15 min 時，CFSE 的濃度和作用時間對標(biāo)記率無明顯影 響(P ＞ 0． 05)。

CFSE 標(biāo)記對 BMSCs 存活率的影響 
10 μmol /L CFSE 標(biāo)記 BMSCs 的時間≤15 min 時，BMSCs 的存活率基本不受影響，但當(dāng)標(biāo)記時間 為 20 min 或 30 min 時，BMSCs 的存活率顯著下降 (P ＜ 0． 05)，僅分別為 92． 67 % 和 70． 33% 。 不同濃度 CFSE 標(biāo)記對 BMSCs 存活率的影響結(jié)果顯 示，2． 5、5、10 μmol /L CFSE 標(biāo)記 BMSCs 15 min 均不 影響細(xì)胞活性(P ＞ 0． 05)，20 μmol /L CFSE 標(biāo)記 15 min 使 BMSCs 的存活率顯著下降為 87． 45 % 。

CFSE 是一種可標(biāo)記活細(xì)胞的熒光染料，具有較 強(qiáng)的細(xì)胞膜通透性。CFSE 進(jìn)入細(xì)胞后，其乙酸基團(tuán) 可被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解去除，喪失膜通透性，而具有很 高的熒光活性，被激發(fā)將發(fā)生綠色熒光。此時的 CFSE 能與細(xì)胞骨架蛋白形成可激發(fā)熒光的蛋白復(fù) 合物，該復(fù)合物不能脫離細(xì)胞，且不會污染鄰近細(xì) 胞，使非標(biāo)記細(xì)胞免受染料影響

本實(shí)驗證明， CFSE 標(biāo)記 BMSCs 的細(xì)胞膜、細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)都帶 有綠色熒光，且標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)不受影響。臺盼藍(lán) 結(jié)果顯示，CFSE 濃度 ＜ 20 μmol /L、標(biāo)記時間 ＜ 20 min 時，BMSCs 的 存 活 率 均 未 受 影 響。Dumitriu 等報道，CFSE 標(biāo)記細(xì)胞后不會引起細(xì)胞的凋亡 或壞死，而且細(xì)胞凋亡壞死后，標(biāo)記的 CFSE 仍能穩(wěn) 定地留存于細(xì)胞中且不影響凋亡和壞死的發(fā)生，以 上結(jié)果同時證明 CFSE 標(biāo)記不影響細(xì)胞的生命活 動。但當(dāng) CFSE 標(biāo)記濃度達(dá)到 20 μmol /L 或標(biāo)記時 間 ＞ 20 min 時，BMSCs 的存活率將會降低，甚至部 分細(xì)胞出現(xiàn)死亡。故在 CFSE 對 BMSCs 標(biāo)記率都達(dá) 到 100% 的前提下，本研究選擇 CFSE 較低的作用濃 度和較短的作用時間，即 10 μmol /L CFSE 標(biāo)記 15 min，作為 CFSE 標(biāo)記 BMSCs 的最佳條件，以在達(dá)到 CFSE 最佳標(biāo)記效果的同時保持最佳的細(xì)胞活性。

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本文參考文獻(xiàn): 
大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外 CFSE 染色標(biāo)記的實(shí)驗研究 
陳若霖1 ，樸豐源1 ，李雙月1 ，王哲敏1 ，戚 媛1 ，劉 爽1 ，關(guān) 懷2 ，金河天3 (1． 大連醫(yī)科大學(xué) 勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 大連 116044; 2．