如何用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞？

　　淋巴細(xì)胞分離液是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，進(jìn)行細(xì)胞的分離純化的常用試劑。常用的淋巴細(xì)胞分離液有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、Percoll淋巴細(xì)胞分離液。Ficoll與Percoll分離單個(gè)核細(xì)胞的方法均為密度梯度離心法。分離原理：外周血中單個(gè)核細(xì)胞和單核細(xì)胞,其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，淋巴細(xì)胞分離液是一種密度介于1.075~1.090之間而近似于等滲的溶液,用它做密度梯度離心,使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

如何用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞？

　　1．抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的無血清緩沖液懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中，水平離心500×g20分鐘。此時(shí)離心管中形成5層：最上面是血漿，血漿層和淋巴細(xì)胞分離液之間是PBMC，淋巴細(xì)胞分離液層和最下面的紅細(xì)胞層之間是粒細(xì)胞層，又成為棕黃層。

　　2．吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個(gè)核細(xì)胞，盡量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％滅活小牛血清的Hanks液（洗滌液），混勻后離心200×g10分鐘，低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板，去上清液。

　　3．再用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次離心500×g10分鐘，洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離液。用1％臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力（應(yīng)>95％）并計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。通常，每毫升外周血可得1×106～2×106PBMC。