2 × 預混實時熒光定量快速PCR反應體系

本產品是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進行實時熒光定量 PCR 的專用 2×濃度預混液。本產品含有優(yōu)化濃度的HotStart Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+、反應緩沖液和穩(wěn)定劑等成分。主要用于基因組 DNA 靶 序列和 RNA 反轉錄后 cDNA 靶序列的檢測。HotStart Taq DNA Polymerase 高溫加熱前，抗 Taq單克隆抗體與 Taq 結合，抑制 Taq 的聚合酶活性，從而抑制在低溫條件下出現的由引物和模板 DNA 非特異性雜交或引物二聚體引起的非特 異性擴增。抗體在 PCR 反應的預變性步驟中已*失活，不會阻礙之后 Taq 酶聚合反應，大大提高了 PCR 反應的靈敏度及特 異性。 優(yōu)化濃度的 SYBR Green I 熒光染料摻入 DNA 雙鏈后，熒光信號增強，而不摻入鏈中 SYBR Green I 染料分子熒光信號不 變，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產物的增加*同步，熒光可以在退火或延伸階段測定。
2 × 預混實時熒光定量快速PCR反應體系本產品為 2×濃度預混實時熒光定量快速 PCR 反應體系，使用時只需加入模板、引物、ROX Reference Dye（用以校正孔與 孔之間產生的熒光信號誤差，根據不同熒光定量 PCR 儀選擇使用）和水，使其工作濃度為 1×，即可進行反應。具有快速簡便、 靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可最大限度地減少人為誤差、節(jié)約 PCR 實驗操作時間、降低污染機率。

2 × 預混實時熒光定量快速PCR反應體系用戶需自備的試劑：cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。
請按照不同品牌熒光定量PCR儀的使用說明書要求進行實驗操作。
操作示例：分別以20 µ l和50 µ l PCR反應體系為例：
1.  PCR 反應體系的建立：

*模板量： 10-100 ng基因組DNA，或 1-10 ng cDNA 為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數不同，可對模板進行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反應的cDNA（ RT 反應液）作為模板時的添加量不要超過 PCR 反應液總體積的10% 。
*引物：通常引物濃度以 0.2 μM 可以得到較好結果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。為了獲得理想的 qPCR 的效果，擴增片段的長度建議為 80-200 bp 。
*不同儀器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，請根據儀器說明進行操作。
2。PCR 反應條件的設置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗體封閉的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反應 前進行模板的預變性，通常設定為95℃、2 min，復雜或高GC模板適當延長時間至5 min。該DNA聚合酶在15 s內可完成至 少300 bp的擴增，可以滿足絕大多數的qPCR實驗；對于超過350 bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60 s或者 采用三步法以提高擴增效率。

 

注 ： 以上舉例為常規(guī) qPCR
反應系統(tǒng)，僅供參考。實際反應條件因模板、引物等的結構不同而各異 ， 需根據模板、引物、目的片段的特點設定最佳反應條件，并根據比例放大或縮小反應體系。
3. 在相應的 real time PCR 儀器上完成實驗，并分析結果。

-20℃避光保存，保質期 24 個月，避免反復凍融。如果經常使用，可置于 4℃保存至少 3 個月。

1. 使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經短暫離心后使用。 2. 盡可能減少 RealStar Green Fast Mixture 在光下的曝露時間，長時間的曝光可導致熒光信號減弱。 3. 反應液的配制、分裝請一定使用無污染的槍頭、Microtube 等，盡量避免交叉污染。 4. 本品不能用于雜交探針法。