CTB標記脂筏(LR)解決方案

脂筏（lipid raft microdomains, LR）是細胞膜上富含膽固醇和鞘脂的微小結構域（圖1），具有物理化學特性，可作為信號轉導、細胞黏附和蛋白質運輸等關鍵生物學過程的調控樞紐。近年研究發現，LR的功能異常與多種疾病密切相關，包括腫瘤、神經退行性疾病和心血管疾病等。由于其重要的病理生理作用，以LR為靶點開發新型治療策略已成為當前研究熱點。

圖1 LR 的結構與組成[1]

霍亂毒素B亞單位（Cholera Toxin B subunit, CTB/ CTxb）是一種廣泛應用于脂筏（Lipid Rafts）標記、內吞作用研究和神經科學的經典工具。愛必信提供的CTB 可用作神經元示蹤劑、細胞膜標記、免疫佐劑等。產品經過嚴格優化，適用于高分辨率成像、流式分析和功能研究。

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2024年10月，上海交通大學醫學院藥理學與化學生物學系俞志華研究團隊在Translational Neurodegeneration（IF=10.8）上發表了題為“TRPV1 alleviates APOE4-dependent microglial antigen presentation and T cell infiltration in Alzheimer’s disease"的研究論文，文中CTxb-FITC（abs80003，霍亂毒素B亞單位偶聯FITC） 被用作脂筏標記物，用于研究 APOE4 對微膠質細胞脂筏結構及抗原呈遞功能的影響，以及 TRPV1 通道的調控作用。

CTxb-FITC在該研究中用于標記細胞膜上的脂筏，具體功能包括：

脂筏定位：CTB結合細胞膜上的GM1神經節苷脂（脂筏的標志性成分），通過FITC熒光標記可視化脂筏的分布。

共定位分析：與MHC II分子（PE標記）的共定位實驗，驗證APOE4如何通過膽固醇積累促進MHC II在脂筏中的聚集，從而增強抗原呈遞功能。

實驗方法[2]

細胞處理：室溫下，用4%多聚甲醛處理BV2小膠質細胞10分鐘。

阻斷與染色：

阻斷液：用含5% BSA的PBS孵育，封閉非特異性位點。

染色：加入CTxb-FITC（8 μg/mL）和MHC II-PE（2 μg/mL），4°C孵育30分鐘。然后再用DAPI染色細胞核。

成像：TCS SP8共聚焦顯微鏡拍攝，ImageJ分析共定位信號。

細胞模型：BV2小鼠小膠質細胞系，用ApoE3/ApoE4（4 μg/mL）和tau蛋白纖維（PHF）處理。

TRPV1激活：辣椒素（capsaicin, 1 μM, abs817025）預處理30分鐘。

脂筏與MHC II共定位：通過CTxb-FITC（abs80003）和MHC II-PE雙標，驗證TRPV1激活后MHC II從脂筏的移位。

流式細胞術：分析MHC II表達。

鈣成像：Fluo-4 AM檢測胞內鈣信號（abs47014952）。

免疫熒光：共聚焦顯微鏡觀察脂筏、MHC II、溶酶體（LysoTracker, abs47038871）等。

1. 樣品處理與固定

避免過度固定：使用4%多聚甲醛（abs9179）固定10-15分鐘（室溫），避免醛類過度交聯破壞脂筏結構。甲醇/丙酮等有機溶劑固定會溶解脂筏，不可使用。

洗滌：固定后用 PBS（無去垢劑） 輕柔洗滌3次，防止脂筏破壞。

阻斷液推薦含5% BSA的PBS 或 1-5% 血清（同源血清最佳），室溫阻斷30分鐘。避免使用含去垢劑（如Triton X-100）的阻斷液，以免溶解脂筏。

濃度優化：CTB-FITC推薦工作濃度1-10 μg/mL（需預實驗確定，過高濃度增加背景），用PH7.4的PBS稀釋。

孵育時間與溫度：4°C孵育30分鐘（減少內吞作用，保持膜表面GM1標記）。若需標記內化GM1，可改為 37°C孵育15-30分鐘。

避光操作：CTB-FITC對光敏感，全程避光。

多色標記順序：先染CTB-FITC（脂筏），固定后再染其他抗體（如MHC II）。若需胞內抗原（如溶酶體蛋白），需在CTB染色后透化（0.1% Saponin，abs815978）。

對照設置：

陰性對照：用甲基-β-環糊精（Me-β-CD，2-5 mM，abs47047467）預處理細胞耗竭膽固醇，CTB信號應消失。

陽性對照：膽固醇富集處理（如LDL加載）。

[1]基于脂筏治療相關疾病的研究進展. 海南醫學院學報

[2]TRPV1 alleviates APOE4-dependent microglial antigen presentation and T cell infiltration in Alzheimer's disease. Transl Neurodegener.