磷酸化抗體使用需要注意哪些事項(xiàng)

樣本處理：

加入抑制劑：在裂解緩沖液（lysis buffer）中必須加入蛋白酶抑制劑和適量的磷酸酶抑制劑，以抑制組織或細(xì)胞裂解過(guò)程中釋放的內(nèi)源性蛋白磷酸酶，防止磷酸化蛋白去磷酸化，從而維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。

確保裂解：建議使用裂解液裂解結(jié)合超聲處理，確保細(xì)胞充分裂解并剪切染色質(zhì)DNA。超聲處理時(shí)應(yīng)保持低溫，避免蛋白降解。

新鮮樣本：使用新鮮制備的樣本，避免反復(fù)凍融，以減少磷酸基團(tuán)的降解。

抗體孵育：

低溫孵育：一抗孵育最好在4°C下進(jìn)行，并過(guò)夜孵育，以確保抗體與目的蛋白充分結(jié)合。低溫有助于維持抗體與抗原的物理吸附，防止高溫下抗原脫落。

稀釋液選擇：根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋液稀釋抗體，通常建議使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST稀釋液，而非含脫脂牛奶的TBST，因?yàn)槊撝Ｄ讨锌赡芎辛姿峄鞍祝绊憣?shí)驗(yàn)結(jié)果。

洗滌條件：

洗滌液選擇：推薦使用TBST作為洗滌液，相對(duì)于PBST，TBST能提供更強(qiáng)的信號(hào)。

洗滌次數(shù)和時(shí)間：洗滌次數(shù)和時(shí)間需要優(yōu)化，以避免信號(hào)減弱或背景增加。通常建議一抗和二抗孵育后，用TBST洗膜3次，每次5分鐘。

封閉條件：

封閉劑選擇：雖然網(wǎng)絡(luò)上流傳磷酸化抗體不適于用牛奶封閉的說(shuō)法，但使用實(shí)驗(yàn)級(jí)脫脂牛奶進(jìn)行室溫封閉1小時(shí)是有效的，且有助于降低非特異性結(jié)合。

封閉時(shí)間：避免膜封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。

對(duì)照設(shè)置：

陽(yáng)性對(duì)照：設(shè)置合適的陽(yáng)性對(duì)照，以確認(rèn)抗體檢測(cè)到的特異性信號(hào)。

總蛋白和內(nèi)參對(duì)照：除了檢測(cè)磷酸化蛋白外，還應(yīng)檢測(cè)該蛋白的總表達(dá)量，以及使用普通內(nèi)參作為體系對(duì)照，保證上樣量一致。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：

低溫環(huán)境：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除超聲處理外，應(yīng)保持低溫環(huán)境，以防止磷酸化蛋白在室溫下被蛋白磷酸酶降解。

結(jié)果分析：

分子量比對(duì)：在壓片后，根據(jù)marker比對(duì)條帶的分子量，確認(rèn)檢測(cè)到的條帶是否正確。

曝光時(shí)間：優(yōu)化曝光或壓片時(shí)間，以避免背景過(guò)深或條帶過(guò)淺。

抗體質(zhì)量：

選擇高質(zhì)量抗體：確保使用的磷酸化抗體質(zhì)量可靠，并嚴(yán)格按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。