脾臟單細(xì)胞懸液制備指南（酶解法）

小鼠脾臟是一個(gè)重要的免疫器官，位于小鼠左側(cè)腹腔中，靠近胃的左側(cè)，呈長(zhǎng)橢圓形狀。大小會(huì)根據(jù)小鼠的品種和健康狀況有所不同，一般來(lái)說(shuō)，成年小鼠的脾臟長(zhǎng)度大約在1.5厘米到2.5厘米之間。脾臟的顏色和質(zhì)地可能會(huì)因?yàn)樾∈蟮钠贩N和健康狀況而有所變化，通常呈現(xiàn)出類似葉片的形態(tài)，顏色暗紅。在實(shí)驗(yàn)研究中，小鼠脾臟細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)是免疫學(xué)研究的重要方法，也是流式細(xì)胞術(shù)分析的前提。

一、耗材與試劑

表1 小鼠脾臟解離部分試劑耗材參考表

表2 產(chǎn)品信息

二、實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：將脾臟小鼠脾臟組織解離試劑盒至于37度水浴鍋中預(yù)熱（脾臟組織解離試劑收到后，推薦分裝凍存），如果使用紅細(xì)胞裂解液為10×，需提前用超純水稀釋成1×。PBS提前預(yù)冷。

1、將小鼠頸部脫臼處死，75%酒精消毒小鼠表面，至于托盤中，左側(cè)腹部朝上，鑷子輔助操作，提起左腹側(cè)中部皮膚，剪開皮膚，肉眼可見暗紅色，長(zhǎng)條狀脾臟，剪開腹膜，鑷子提起脾臟，見到分離，盡可能的除去結(jié)締組織和脂肪，PBS沖洗，取新鮮小鼠脾臟組織100mg-200mg左右（一個(gè)20g的小鼠，脾臟重量可能在100mg左右，具體以實(shí)際情況為準(zhǔn)）加至50mL無(wú)菌離心管中，用眼科剪將組織che底剪碎至1-2mm³，加入小鼠脾臟組織解離試劑1mL；

2、將離心管置于恒溫?fù)u床上，37℃/180rpm震蕩孵育30min左右，消化小鼠脾臟組織，可根據(jù)組織狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整消化時(shí)間（脾臟相對(duì)比較好消化），混懸液中肉眼無(wú)明顯組織塊時(shí)，取少量懸液倒置顯微鏡下觀察，可輔助判斷，有大量活細(xì)胞即可停止消化（中心明亮），也可用臺(tái)盼藍(lán)染色或者其他方式；

紅色圈內(nèi)：死細(xì)胞 綠色圈內(nèi)：活細(xì)胞

3、孵育結(jié)束后將離心管內(nèi)的組織勻漿用70um無(wú)菌過濾器過濾，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗無(wú)菌過濾器，用50mL的離心管收集濾液；

4、將收集的濾液1200rpm離心5min ，棄上清；

5、可使用紅細(xì)胞裂解液去除組織解離過程中的紅細(xì)胞，具體操作為，向第4步所得的沉淀加入3mL 1×紅細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，渦旋混勻，室溫下避光孵育3-5min，加入2mL預(yù)冷的PBS, 1200rpm離心 5min，棄上清。重復(fù)洗滌一次；

6、棄上清，細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5-10×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，將100uL/管的細(xì)胞懸液分配到12×75mm的流式管中，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、問題及策略

1、細(xì)胞得率低

一般情況下，成年C57BL/6小鼠一個(gè)脾臟可解離出大約10×10⁸–1.4×10⁸個(gè)細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞得率特別低，需要注意，樣本獲取階段要盡可能完quan去除組織周圍的脂肪，盡可能將組織剪碎，從而提高細(xì)胞產(chǎn)量。在涉及的清洗步驟中，倒出上清液前，先用移液槍吸棄上層脂肪（可將槍頭jian端修剪一下，避免吸氣時(shí)堵塞）

2、細(xì)胞活率低，死細(xì)胞/碎片多

首先，解離試劑孵育的時(shí)間不能過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間孵育會(huì)造成細(xì)胞活力降低及表面標(biāo)記物丟失，死細(xì)胞過多，釋放DNA絲纏繞，導(dǎo)致溶液粘稠，其次，千萬(wàn)不要縮短清洗的步驟，清洗可以幫助去除粘連體、碎片和死細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液的孵育時(shí)間也不能過長(zhǎng)，一般5min即可，如果細(xì)胞活力還是很低，建議檢查紅細(xì)胞裂解液是否新鮮有效。

3、紅細(xì)胞裂解不wan全

表現(xiàn)為洗滌步驟后出現(xiàn)明顯的紅色沉淀。確保制備新鮮的紅細(xì)胞裂解緩沖液，在室溫下進(jìn)行裂解。裂解開始前，要確保細(xì)胞已wan全重懸，裂解時(shí)間不能過短。

四、解離效果

該試劑盒講小鼠Spleen組織處理為單細(xì)胞懸液后做流式：細(xì)胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

注：本產(chǎn)品僅作科研實(shí)驗(yàn)使用，不支持臨床等研究

五、其他產(chǎn)品推薦

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...