脾臟單細胞懸液制備指南（酶解法）

小鼠脾臟是一個重要的免疫器官，位于小鼠左側腹腔中，靠近胃的左側，呈長橢圓形狀。大小會根據小鼠的品種和健康狀況有所不同，一般來說，成年小鼠的脾臟長度大約在1.5厘米到2.5厘米之間。脾臟的顏色和質地可能會因為小鼠的品種和健康狀況而有所變化，通常呈現出類似葉片的形態(tài)，顏色暗紅。在實驗研究中，小鼠脾臟細胞的分離、培養(yǎng)和計數是免疫學研究的重要方法，也是流式細胞術分析的前提。

一、耗材與試劑

表1 小鼠脾臟解離部分試劑耗材參考表

表2 產品信息

二、實驗步驟

實驗前準備：將脾臟小鼠脾臟組織解離試劑盒至于37度水浴鍋中預熱（脾臟組織解離試劑收到后，推薦分裝凍存），如果使用紅細胞裂解液為10×，需提前用超純水稀釋成1×。PBS提前預冷。

1、將小鼠頸部脫臼處死，75%酒精消毒小鼠表面，至于托盤中，左側腹部朝上，鑷子輔助操作，提起左腹側中部皮膚，剪開皮膚，肉眼可見暗紅色，長條狀脾臟，剪開腹膜，鑷子提起脾臟，見到分離，盡可能的除去結締組織和脂肪，PBS沖洗，取新鮮小鼠脾臟組織100mg-200mg左右（一個20g的小鼠，脾臟重量可能在100mg左右，具體以實際情況為準）加至50mL無菌離心管中，用眼科剪將組織che底剪碎至1-2mm³，加入小鼠脾臟組織解離試劑1mL；

2、將離心管置于恒溫搖床上，37℃/180rpm震蕩孵育30min左右，消化小鼠脾臟組織，可根據組織狀態(tài)適當調整消化時間（脾臟相對比較好消化），混懸液中肉眼無明顯組織塊時，取少量懸液倒置顯微鏡下觀察，可輔助判斷，有大量活細胞即可停止消化（中心明亮），也可用臺盼藍染色或者其他方式；

紅色圈內：死細胞 綠色圈內：活細胞

3、孵育結束后將離心管內的組織勻漿用70um無菌過濾器過濾，然后加入細胞培養(yǎng)基沖洗無菌過濾器，用50mL的離心管收集濾液；

4、將收集的濾液1200rpm離心5min ，棄上清；

5、可使用紅細胞裂解液去除組織解離過程中的紅細胞，具體操作為，向第4步所得的沉淀加入3mL 1×紅細胞裂解液，重懸沉淀，渦旋混勻，室溫下避光孵育3-5min，加入2mL預冷的PBS, 1200rpm離心 5min，棄上清。重復洗滌一次；

6、棄上清，細胞染色緩沖液重懸細胞沉淀，并調整細胞濃度至5-10×10⁶個細胞/mL，將100uL/管的細胞懸液分配到12×75mm的流式管中，進行后續(xù)實驗。

三、問題及策略

1、細胞得率低

一般情況下，成年C57BL/6小鼠一個脾臟可解離出大約10×10⁸–1.4×10⁸個細胞，如果發(fā)現細胞得率特別低，需要注意，樣本獲取階段要盡可能完quan去除組織周圍的脂肪，盡可能將組織剪碎，從而提高細胞產量。在涉及的清洗步驟中，倒出上清液前，先用移液槍吸棄上層脂肪（可將槍頭jian端修剪一下，避免吸氣時堵塞）

2、細胞活率低，死細胞/碎片多

首先，解離試劑孵育的時間不能過長，長時間孵育會造成細胞活力降低及表面標記物丟失，死細胞過多，釋放DNA絲纏繞，導致溶液粘稠，其次，千萬不要縮短清洗的步驟，清洗可以幫助去除粘連體、碎片和死細胞，紅細胞裂解液的孵育時間也不能過長，一般5min即可，如果細胞活力還是很低，建議檢查紅細胞裂解液是否新鮮有效。

3、紅細胞裂解不wan全

表現為洗滌步驟后出現明顯的紅色沉淀。確保制備新鮮的紅細胞裂解緩沖液，在室溫下進行裂解。裂解開始前，要確保細胞已wan全重懸，裂解時間不能過短。

四、解離效果

該試劑盒講小鼠Spleen組織處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結果

注：本產品僅作科研實驗使用，不支持臨床等研究

五、其他產品推薦

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