chip-seq+多色Absin助力！探究p53調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的潛在機(jī)制

作為癌癥中最常見的基因改變，超過一半的人類癌癥都有p53突變，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活。然而，p53如何調(diào)節(jié)"immune landscape"，為免疫逃逸創(chuàng)造有力條件仍然難以捉摸。該項研究中發(fā)現(xiàn)，癌癥干細(xì)胞(CSCs)建立了一個白細(xì)胞介素-34(IL-34)協(xié)調(diào)的生態(tài)位，以促進(jìn)p53缺失的肝癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展。在機(jī)制上發(fā)現(xiàn)IL-34是一個被p53轉(zhuǎn)錄抑制的基因，而p53缺失導(dǎo)致CSCs分泌IL-34。IL-34誘導(dǎo)cd36介導(dǎo)的脂肪酸氧化代謝升高，從而驅(qū)動泡沫樣腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)的M2樣極化。這些IL-34協(xié)調(diào)的TAMs抑制CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，以促進(jìn)免疫逃逸。阻斷IL-34-CD36軸可引起抗腫瘤免疫，并與抗pd-1免疫治療協(xié)同作用，導(dǎo)致完quan應(yīng)答。該研究結(jié)果揭示了p53調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的潛在機(jī)制，并為p53失活的癌癥免疫治療提供了一個潛在的靶點。

文章：Interleukin-34-orchestrated tumor-associated macrophage reprogramming is required for tumor immune escape driven by p53 inactivation IF=25.5

對Trp53WT和Trp53缺失的腫瘤進(jìn)行了rna測序，結(jié)合q-PCR、ELISA和免疫印跡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CSCs在Trp53缺失的腫瘤樣本表達(dá)的IL-34顯著升高，多重免疫組化染色顯示IL-34和EpCAM共定位于Trp53缺失的腫瘤，EpCAM+ CD47+ CSCs在Trp53缺失的腫瘤中不表達(dá)p21。這些結(jié)果共同表明，p53失活的CSCs是分泌IL-34的主要細(xì)胞亞群。

圖1 由p53失活的CSC異常高分泌的IL-34促進(jìn)了肝癌的腫瘤發(fā)生

為了驗證p53可能抑制IL34轉(zhuǎn)錄的猜測，使用abs50034染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試劑盒采用ChIP-seq(K)+ChIP-qPCR(L)+DNA pull down(M)聯(lián)合證實p53可直接抑制IL34的轉(zhuǎn)錄！

圖2 ChIP-seq(K)+ChIP-qPCR(L)+DNA pull down(M)

(K)染色體視圖圖顯示了p53在IL34和CDKN1A的啟動子上的結(jié)合（p21；陽性對照）。

(L)用對照抗體IgG或抗p53或抗rna聚合酶II對HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀，然后用IL34啟動子引物進(jìn)行PCR。

(M)免疫印跡分析生物素化和未生物素化的IL34啟動子探針的下拉沉淀（與HepG2細(xì)胞提取物）

考慮到IL-34是參與單核細(xì)胞增殖、存活和向巨噬細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，研究者用CIBERSORT研究了肝臟腫瘤免疫細(xì)4胞的組成，發(fā)現(xiàn)IL-34的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的比例呈正相關(guān)。空間轉(zhuǎn)錄組測序和多重免疫組化結(jié)果表明Trp53null腫瘤中的大多數(shù)tam是單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(MDMs)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在trp53缺失的腫瘤中，tam在分泌il-34的CSCs附近積累，基因集富集分析表明，來自Trp53null腫瘤的tam在脂滴特征上富集，BODIPY脂肪酸探針對tam進(jìn)行染色表明，trp53缺失腫瘤中的tam類似于泡沫樣巨噬細(xì)胞，差異基因分析顯示，Trp53null腫瘤中CD206+和CD163+巨噬細(xì)胞的比例增加，這些結(jié)果共同表明，積聚在csc附近的tam表現(xiàn)出脂質(zhì)負(fù)載的促腫瘤表型。Trp53^+/+ 或Trp53^-/-與骨髓源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測發(fā)現(xiàn)，IL-34在Trp53null腫瘤中促進(jìn)脂質(zhì)積累和tam的促腫瘤極化。

圖3 IL-34在p53失活的CSCs附近誘導(dǎo)泡沫樣tam

在接下來的實驗中，研究者證明了IL-34通過CD36促進(jìn)脂肪酸攝取，并通過FAO代謝重編程誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的促腫瘤極化，為了提供IL-34-CD36軸在體內(nèi)促進(jìn)TAM脂質(zhì)積累和m2樣巨噬細(xì)胞極化的直接證據(jù)，研究者將Il34過表達(dá)的CT細(xì)胞(Trp53+/+)和Il34基因敲除的PT細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Il34過表達(dá)的腫瘤中tam的比例高于CT腫瘤，通過注射氯膦酸脂體對巨噬細(xì)胞進(jìn)行全身耗竭，il-34缺陷PT腫瘤與對照PT腫瘤之間的腫瘤生長差異被消除，流式細(xì)胞術(shù)和共培養(yǎng)實驗表明，IL-34-CD36軸協(xié)調(diào)的TAM通過抑制Trp53null肝癌中的T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫來促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。

在隨后的小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，用抗IL-34或CD36的中和抗體治療Trp53/PT腫瘤小鼠，IL-34或CD36的抗體阻斷導(dǎo)致腫瘤生長明顯受限，對TP53突變的肝癌的公共單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)的分析表明，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)IL34，TAM表現(xiàn)出強(qiáng)勁的CD36表達(dá)，而其在所有其他細(xì)胞類型中的表達(dá)都很弱?？傊?，結(jié)果表明，阻斷IL-34信號傳導(dǎo)可能成為TP53突變癌癥患者的潛在免疫療法。

圖4 阻斷IL-34信號可抑制肝癌生長并導(dǎo)致p53失活

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