類器官污染鑒別與除菌攻略（一）

一、概述

類器官污染是一個老生常談的事情，尤其是做胃腸道，組織本身帶來的菌群數(shù)量非常龐大，一旦消毒不到位，就會導(dǎo)致類器官培養(yǎng)失敗。類器官污染常見類型有細(xì)菌、真菌、支原體、黑膠蟲等污染源，今天小愛帶大家學(xué)習(xí)鑒別類器官污染及除菌方案。

二、類器官污染鑒別

1、細(xì)菌污染

細(xì)菌污染-肉眼下

污染特征：

● 肉眼下可明顯觀察基質(zhì)內(nèi)有明顯黑色球體物；

● 而且呈多個黑色球狀物分布；

● 生長迅速，通常D1就有會出現(xiàn)；

● 培養(yǎng)液隔夜即會變紅黃渾濁。

細(xì)菌污染-鏡下類器官原代提取D1

細(xì)菌污染特征：

● 細(xì)菌集落呈黑色團(tuán)球狀，wan全不透；

● 外圍模糊，有朦朧感；

● 爆發(fā)非常快，一般1-2天即可出現(xiàn)大量集落。

細(xì)菌克星

2、真菌污染

左圖 真菌污染特征——霉菌

右圖 真菌污染特征——根霉

霉菌污染特征：

● 早期并不會使得培養(yǎng)基變黃變渾濁，但在顯微鏡下可觀察到菌絲體；

● 真菌形成的菌絲呈絲狀，管狀，樹枝狀，串珠狀。

真菌污染——酵母菌

小鼠胃類器官P0D1中發(fā)現(xiàn)的酵母菌團(tuán)從左到右依次是4X、10X、20X

類器官基質(zhì)膠中的酵母菌污染

類器官基質(zhì)膠中的酵母菌+根霉污染

酵母菌污染特征：

● 酵母菌呈類似棉花絮狀的團(tuán)狀物；

● 酵母菌等，當(dāng)其行出芽生殖時可從一大一小的連體結(jié)構(gòu)識別；

● 細(xì)胞被污染后，仍可生長，長時間類器官活力狀態(tài)會變差；

● 梅雨季時的污染率會提高。

真菌克星

3、黑膠蟲

黑膠蟲污染特征：

● 活躍扭動；

● 多呈桿狀；

● 培養(yǎng)基不渾濁。

黑膠蟲清除劑PLUS (500×) abs9841

產(chǎn)品優(yōu)勢：

1）性能穩(wěn)定：通過細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測；通過滲透壓、pH檢測；通過產(chǎn)品性能檢測；

2）高效快速：有效實(shí)現(xiàn)對“黑膠蟲"的抑制和滅殺，減少不必要的實(shí)驗(yàn)損失；

3）環(huán)保安全：經(jīng)上百種細(xì)胞驗(yàn)證無毒害作用。

使用方法：

1）請?jiān)谑盏截浐螅?將試劑管瞬時離心(3000rpm，3~5s)保存；

2）使用黑膠蟲清除劑處理時， 建議現(xiàn)配現(xiàn)用， 并保持細(xì)胞密度在50%~60%；

3）推薦稀釋比例為1:500。例如5mL培養(yǎng)基中加入10μL的黑膠蟲清除劑。丟棄舊的培養(yǎng)基， 用PBS將細(xì)胞清洗干凈， 再加入含有黑膠蟲清除劑的新鮮培養(yǎng)基， 2天一次，連續(xù)處理一周。

黑膠蟲預(yù)防劑（1000×）abs9842

產(chǎn)品優(yōu)勢：

1）高效穩(wěn)定：通過產(chǎn)品性能檢測，能夠有效防治細(xì)胞培養(yǎng)中的“黑膠蟲"污染問題；

2）環(huán)保安全：對細(xì)胞無毒性作用，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不會對細(xì)胞造成影響，本產(chǎn)品為多肽類，不像抗生素會影響細(xì)胞生長狀態(tài)并讓細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。

使用方法：

1）使用黑膠蟲預(yù)防劑(1000X)時， 建議現(xiàn)配現(xiàn)用；

2）推薦黑膠蟲預(yù)防劑(1000X)的稀釋比例為1:1000, 例如：10mL的培養(yǎng)基加入10μL的黑膠蟲預(yù)防劑(1000X)。

4、支原體污染

支原體是實(shí)驗(yàn)室中常見的污染細(xì)胞的原核生物，污染主要來自組織、血清等動物性原材料和操作者本身。支原體直徑在0.1-0.3μm，顯微鏡下也很難分辨，一般通過吸取培養(yǎng)液上清采用qPCR技術(shù)擴(kuò)增DNA檢測。

1）檢測原理

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，其5’末端攜帶熒光基團(tuán)（報(bào)告基團(tuán)），如FAM、CY5、VIC等，3’端攜帶淬滅基團(tuán)，如TAMRA、BHQ1等。PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一條特異性的熒光探針，探針完整時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)（熒光定量PCR儀）可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。本試劑盒采用多重PCR的方法，用2種不同的熒光探針分別檢測目標(biāo)序列與內(nèi)參。

2）清除試劑

支原體清除試劑Plus abs9253

產(chǎn)品優(yōu)勢：

● 特異性清除培養(yǎng)基中的支原體；

● 只需要3-6天，便可以有效清除支原體；

● 活性成分為抗生素，不會產(chǎn)生耐藥性；

● 對細(xì)胞幾乎無毒性，在100多種細(xì)胞上進(jìn)行過驗(yàn)證，包括但不限于HEK293、Hela、MCF-7、MRC-5、NIH-3T3、CCC-ESF、CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、H295R、HL-60、K562、MDA-MB-231、SP2/0、T47D、BM和BV2等；

● 廣譜性，可替代雙抗，可以清除常見的革蘭氏陰性和陽性菌；

● 可直接加入血清、培養(yǎng)基中，用于清除支原體污染。

3）使用方法

A、儲存液的配制： 

稱取適量支原體清除試劑，配制成10mg/mL的儲存液。適當(dāng)分裝后-20℃保存。如長時間不使用，也可以-80℃保存；

B、預(yù)防支原體污染或抑制支原體：

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量支原體清除試劑儲存液，使最終濃度為0.01-0.5μg/mL，通常推薦使用的濃度為0.2μg/mL或0.5μg/mL。在添加了前述劑量的支原體清除試劑的情況下，可以有效防止支原體污染或抑制支原體增殖；

C、清除污染的支原體：

對于發(fā)現(xiàn)或懷疑有支原體污染的細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量支原體清除試劑儲存液，使最終濃度為0.5-250μg/mL。推薦依次嘗試使用25、50、100和250μg/mL這4個濃度。在添加了前述劑量的支原體去除試劑的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后，檢測是否還存在支原體污染。如果還是存在支原體污染，可以酌情提高支原體清除試劑的工作濃度。

5、非污染情況

因?yàn)轭惼鞴僭囵B(yǎng)中，會有很多雜質(zhì)、組織碎片、成纖維細(xì)胞等，容易造成細(xì)胞“污染"的假象，其實(shí)并非污染，如下所示：

1）成纖維細(xì)胞

成纖維細(xì)胞的胞體細(xì)長，又呈纖維樣，很容易被誤認(rèn)為是菌絲體，被誤判成真菌污染。其實(shí)仔細(xì)觀察，成纖維細(xì)胞成梭形，胞體中間粗，兩頭細(xì)長，而菌絲體整體粗細(xì)均勻。

左圖 基質(zhì)膠底層貼壁生長的成纖維細(xì)胞

右圖 真菌污染特征——霉菌

2）組織碎片

在提取原代細(xì)胞的過程中，在組織解離過程中產(chǎn)生很多細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，故原代培養(yǎng)背景會比較臟，這種情況也容易被誤認(rèn)為污染。接下來，小愛帶大家了解一下組織碎片特點(diǎn)：

● 原代組織碎片往往成不規(guī)則形狀，區(qū)別于菌團(tuán)橢圓形菌落形態(tài)；

● 原代組織雜質(zhì)往往大小不一，形態(tài)各異；菌團(tuán)形態(tài)均一，均為橢圓狀。

今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問題，歡迎一起交流哦！

本期小愛推薦

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...