抗體/蛋白標記染料選擇指南及常見問題解答

在當今生物醫學研究領域，精準、高效地識別和追蹤目標分子是解鎖疾病機制、開發新型藥物以及推動個性化醫療的關鍵?？贵w/蛋白標記技術作為一種強大的工具，在這一過程中發揮著不可替代的作用。通過將特定的化學標簽（如熒光染料、酶或放射性同位素）與抗體或蛋白質共價結合，研究人員能夠以更高的靈敏度和特異性對復雜生物系統中的目標分子進行可視化和定量分析。

常見抗體/蛋白標記技術

熒光素標記：使用熒光素如Alexa Fluor系列（AF488\AF594\AF647等）、Cy系列（Cy3\Cy5\Cy7等）、FITC等與抗體或蛋白結合，常用于流式細胞術、免疫熒光和活體成像等實驗；

酶標記：如辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)標記，通過催化底物生成有色產物或化學發光，用于ELISA、Western Blot、免疫組化等實驗；

生物素標記：生物素(Biotin)標記法是利用生物素與抗體或蛋白等生物大分子的氨基結合，廣泛應用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究。

一、Alexa Fluor系列染料概述

Alexa Fluor染料是羅丹明等染料的衍生物，利用磺酸或磺酸鹽代替羅丹明等染料中的氫原子合成。主要應用于生物研究中對組織、細胞和生物分子的標記和定位。標記抗體和蛋白的Alexa Fluor系列染料其發射光譜、激發光譜、常用的激發光和等效染料如表1所示。其中較常用的是綠色熒光探針Alexa Fluor 488。與絕大部分常用的綠色熒光探針相比，Alexa Fluor 488更加明亮，不容易熒光猝滅，背景更低。

表1 常用標記抗體/蛋白的Alexa Fluor系列染料

抗體/蛋白Alexa Fluor標記原理及優勢

Alexa Fluor標記利用了高效和簡單的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯化學反應，選擇性地將Alexa Fluor染料與鄰近蛋白質的氨基基團（-NH₂，包括賴氨酸側鏈和氨基端）相連接，共價結合形成一個穩定的琥珀酰亞胺酯結構（圖1）。

圖1 NHS酯反應示意圖

R表示具有NHS酯反應基團的標記試劑或交聯劑的一端；P表示含有伯胺(-NH₂)的蛋白分子

Alexa Fluor系列染料具有以下優勢：

①發射光譜窄。相較于傳統有機熒光染料，Alexa Fluor染料具有較窄的發射光譜，從而降低不同檢測的交叉水平；

②熒光強度強，光穩定性好；

③受溫度和pH的影響較?。?/span>

④具有良好的水溶性。無需有機試劑Alexa Fluor染料即可結合蛋白質，且儲存不易產生沉淀；

⑤Alexa Fluor系列染料具有不同的顏色，可根據實驗需要，用不同Alexa Fluor染料標記不同的對象，從而實現區分。

二、Cy系列染料概述

Cy是花菁(Cyanine)的縮寫，也叫菁染料。Cy染料性能優良，摩爾吸光系數在熒光染料中是最高的。通常情況下，根據需要標記的生物分子可標記基團（如胺基、醛基或巰基）以及酸堿性，選擇相應的活化（NHS酯、羧酸基團、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺等）染料和反應條件 。其NHS酯是較常用的脂肪氨基標記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標記和檢測。其中菁染料Cy3和Cy5 已成為基因芯片的選擇熒光標記物；另外，Cy5、Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區背景非常低，是熒光強度最高、且穩定的長波長染料，特別適合于活體小動物體內成像代替放射性元素（圖2）。

圖2 Cy3(左)，Cy5(中)和Cy7(右)染料的最大吸光度(虛線)和發射光(陰影區域)

Cy系列染料的優點：

①光譜窄，信號強，靈敏度高；

②染料的摩爾吸光系數高于其他熒光染料；

③染料細胞毒性小，可用于標記抗體、蛋白、細胞；

④熒光波段在近紅外區段的組織透過性好，非常適合做小鼠活體成像。

三、HRP和ALP標記概述

辣根過氧化物酶（HRP, Horseradish Peroxidase）和堿性磷酸酶（ALP, Alkaline Phosphatase）是兩種常用的酶標記，它們可以與抗體結合，用于各種免疫學檢測方法中，如ELISA、Western blotting、免疫組化等。這些酶標記的抗體能夠通過特定的底物反應產生可檢測的信號，從而幫助定量或定位目標抗原。

辣根過氧化物酶（HRP）特點：HRP是一種非常穩定的酶，在廣泛的pH范圍內都能保持活性。它催化過氧化氫（H₂O₂）與某些供氫體之間的反應，生成有色產物或發光信號。

應用：

①ELISA：在酶聯免疫吸附測定中，HRP標記的二抗可以用來檢測被固定在板上的抗原-一抗復合物。

②Western Blotting：HRP標記的抗體可用于識別并顯色轉印到膜上的蛋白質條帶。

③免疫組化：HRP標記抗體用于組織切片中的抗原定位，通過染色來觀察細胞內的特定分子。

堿性磷酸酶（ALP）特點：ALP在堿性條件下較活躍，它能去除磷酸根基團，將無色的磷酸酯底物轉化為有顏色的產物。相比于HRP，ALP可能對一些底物顯示出更高的特異性和穩定性。在某些情況下，ALP產生的信號比HRP更持久，這有助于提高低豐度抗原的檢測能力。

應用：

①ELISA：類似于HRP的應用，但通常使用不同的底物。

②免疫組化：ALP特別適合用于需要長時間染色或保存染色結果的情況。

③原位雜交：ALP也常用于核酸探針的標記，以便在細胞內定位DNA或RNA。

四、生物素標記概述

生物素（Biotin）是一種小分子維生素，也稱為維生素H或B7。經活化后（Biotin-NHS）可與蛋白/抗體等生物大分子的氨基結合，不僅可以很好地保持大分子的生物活性，而且與親和素結合使用時具有多級放大作用，使其廣泛應用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究。

在進行生物素標記時，需要注意幾個關鍵點：

① 待標記物的濃度不應過低，以確保標記效率；

② 生物素與待標記物的比例要合適，以避免影響待標記物的活性；

③ 為了減少空間位阻的影響，可以在生物素與被標記物之間加入交聯臂結構；

④標記反應后的純化步驟至關重要，以去除未反應的生物素和其它雜質。

常見問題解答

Q1：蛋白標記FITC損耗怎么樣？

A1：損失比較小，有95%以上的收率。

Q2：AF488標記抗體的原理？

A2：基于N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯的化學反應，該反應可以與抗體分子中的伯胺基團(-NH2)形成穩定的酰胺鍵，之后脫鹽柱去除游離的染料。

Q3：流式實驗，抗體標記推薦什么染料合適？

A3：流式實驗需要純化，不建議PE（收率只有20%左右）和APC標記（收率50%左右）可以推薦小分子熒光標記，如FITC、AF系列，Cy系列等，標記效率很高，可以滿足流式實驗。

Q4：抗體中含有50%的甘油，可以標記嗎？

A4：可以，我們會先進行透析，去除甘油后再進行標記。

Q5：生物素標記蛋白，有標記效率及COA嗎？

A5：95%以上的標記效率，呈正態分布，蛋白和生物素1:3，按照標準流程標記。COA有的，COA里包含濃度，體積和buffer信息。

Q6：標記的抗體/蛋白如何保存？

A6：無論是熒光染料偶聯抗體、酶偶聯抗體還是生物素偶聯抗體，都需要保存在深色瓶內，或者包裹上鋁箔紙。收到產品后立即分裝，避免反復凍融。不要在HRP偶聯抗體中加入疊氮hua鈉，因為這種保護劑會抑制HRP的活性。短期儲存放在4℃（1-2周），如果需要長期儲存，應加入冷凍保護劑（如甘油）后置于-20℃下保存。

Absin可以提供多種常見熒光素FITC\AF488\AF594\AF647/CY3/CY5/ CY5.5/CY7以及HRP或者生物素的標記，體系成熟，目前常規染料標記周期1-2周。

此外，我司還可提供產品定制和實驗服務，包括定制抗體、定制多肽、定制蛋白、定制mRNA、定制腫瘤/傳染病抗原特異性T細胞含量檢測刺激物、多重熒光免疫組化服務、ELISA服務、生化檢測服務、TR-FRET服務、標記、純化等服務。更多定制需求請聯系我們。

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