IHC實驗難題破解：常見問題與應對策略

免疫組化(IHC)是一種用于檢測組織或細胞中特定蛋白質表達的實驗技術。這項技術在醫學研究和診斷中非常重要，但實驗過程中可能會遇到一些問題。讓小愛帶你來看看常見問題的應對策略吧~

無染色

1、一抗和二抗不兼容

- 使用抗一抗種屬來源的二抗（例如，如果一抗是兔來源的，則使用抗兔的二抗）。確認二抗是否識別一抗的亞型。

2、沒有足夠的一抗與目的蛋白結合

- 使用更高濃度的抗體。

- 4℃下長時間孵育（如過夜孵育）。

3、抗體可能不適用于IHC，因為其可能無法識別蛋白的天然(3D)形式

- 查看抗體使用說明書，確認抗體是否經過IHC驗證以及驗證的IHC類型（福爾馬林或PFA固定、冰凍切片等）。在ICC或IP中成功使用抗體也能說明抗體可以識別天然形式的蛋白。

- 在天然（非變性）WB中檢測抗體，以確保其仍然有效。

4、一抗/二抗/信號放大試劑盒可能因儲存不當、稀釋不當或多次反復凍融而失去活性

- 設置陽性對照，以確保這些試劑仍然有效。

5、該蛋白不存在于目標組織中

- 設置文獻中或抗體供應商推薦的陽性對照。

6、目的蛋白在組織中含量并不豐富

- 采用信號放大步驟，將信號zui大化。

7、二抗未避光保存（進行熒光檢測時）

- 始終避免二抗暴露于光照中。

8、脫蠟可能不充分

- 延長切片的脫蠟時間，使用新配制的二甲苯。

9、固定步驟可能會改變抗體識別的抗原表位

- 使用不同的抗原修復方法來暴露抗原表位（包括使用pH值為6或9的緩沖液進行熱抗原修復、酶抗原修復等）。

- 縮短切片固定時間。

10、抗體不能穿透蛋白所定位的細胞核（核蛋白）。

- 向封閉緩沖液和抗體稀釋液中加入強效通透劑（如Triton™ X-100，貨號：abs9149）。

11、PBS緩沖液被細菌污染，細菌會破壞目的蛋白上的磷酸基團（磷酸化蛋白）

- 在PBS抗體儲存緩沖液中加入0.01%疊氮化物或使用新配制的無菌PBS。

12、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合

- 建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復。

非特異染色

1、一抗/二抗濃度可能過高

- 嘗試降低抗體濃度或縮短孵育時間。與不表達靶蛋白的組織的信號強度進行比較。

2、內源性過氧化物酶具有活性

- 使用酶抑制劑，即對AP使用左旋咪唑(2mM)，或對過氧化物酶使用H2O2(0.3% v/v)。

3、使用與染色組織相同種屬來源的一抗（例如在小鼠組織上使用小鼠一抗）。應用二抗時，由于二抗是靶向組織種屬的，與組織中的免疫球蛋白或蛋白的Fc片段結合

- 使用種屬來源與組織切片不同的一抗，或用F(ab)片段二抗封閉。

4、切片/細胞已干燥

- 保持切片/細胞高度濕潤，勿讓其變干。

5、一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色

- 建議試用單克隆抗體看看。

6、非特異性組分與抗體結合

- 這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。

組織形態不清晰或受損

1、抗原修復方法可能過于苛刻

- 改變抗原修復步驟或嘗試不同的抗原修復方法。

2、組織可能未充分固定

- 延長固定時間。

- 提高固定劑與組織的比例。

- 切割更小塊的組織，進行更有效的固定（浸泡固定）。

3、組織切片從載玻片上脫落（冰凍切片）

- 延長固定時間。

- 嘗試更換固定劑。

- 使用新鮮制備的載玻片。

4、組織切片撕裂或折疊，或切片下方可見氣泡

- 使用鋒利的刀片重新切片。

- 研究不受影響的組織區域。使用PAP筆（貨號：abs929）定位試劑。

5、組織形態難以分辨

- 將組織切片切的更薄。

- 冰晶可能破壞切片形態

- 重新切片，快速冷凍（冷凍切片）。

6、組織自溶

- 延長固定時間。

- 增加固定劑相對于組織的比例。

- 嘗試使用交聯固定劑。

高背景

1、沒有對非特異性結合進行封閉或封閉不充分

- 延長封閉時間，并考慮更換封閉試劑。如果使用血清，我們推薦使用二抗種屬的10%正常血清封閉1h（貨號：abs933）?；蛘撸瑖L試采用商品化的封閉緩沖液，或使用樣本種屬免疫球蛋白預吸附的二抗。

2、一抗濃度可能過高

- 測試抗體的最佳濃度，梯度稀釋抗體，并在4℃下孵育。

3、孵育溫度可能過高

- 4℃下孵育切片。

4、二抗可能存在非特異性結合

- 使用不加一抗的二抗對照。

- 如果在單獨使用二抗時觀察到著色，則應更換二抗，或使用樣本種屬免疫球蛋白預吸附的二抗。

5、組織洗滌不充分；仍然存在固定劑

- 各個步驟之間，用PBS或TBS充分洗滌組織。添加表面活性劑，例如0.1% Triton。

6、內源性過氧化物酶具有活性

- 使用酶抑制劑，即對AP使用左旋咪唑(2mM)，或對過氧化物酶使用H2O2 (0.3% v/v)。

7、固定步驟導致自發熒光（如果使用熒光檢測）

- 福爾馬林/PFA通常會在綠色光譜中產生自發熒光，因此可以嘗試使用紅色光譜范圍內的熒光基團。

- 如果有可用的紅外檢測系統，則使用紅外范圍內的熒光基團。

8、組織內自發熒光（如果使用熒光檢測）

-如果自發熒光不需要保留，可以使用組織自發熒光淬滅劑（貨號：abs9860）

9、信號放大過多（間接檢測技術）

- 縮短信號放大試劑孵育時間，稀釋二抗或信號放大試劑。

10、底物過多（酶檢測）

- 進一步稀釋底物，或縮短底物孵育時間。

11、色原與組織樣品中存在的PBS反應（酶檢測）

- 先使用Tris緩沖液洗滌切片，再與底物一起孵育，然后在Tris緩沖液中洗滌切片/細胞（特別注意，僅適用于AP）。

IHC實驗雖然在技術上要求較高，但通過仔細的實驗設計、嚴格的操作流程和及時的問題解決，可以獲得高質量的實驗結果。面對IHC實驗中的問題，研究人員需要耐心和細致，不斷優化實驗條件，以確保實驗的成功。

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