全國服務(wù)咨詢熱線:

                15000105423

                article技術(shù)文章
                首頁 > 技術(shù)文章 > 免疫細胞培養(yǎng)攻略之樣本制備(一)

                免疫細胞培養(yǎng)攻略之樣本制備(一)

                更新時間:2024-06-28      點擊次數(shù):1259

                免疫細胞(immune cells)是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞,包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等,其在免疫細胞療法中扮演著至關(guān)重要的角色。免疫細胞療法,即通過采集身體中的免疫細胞,經(jīng)過體外培養(yǎng),擴增,最后回輸?shù)襟w內(nèi),來增強機體對疾病的抵抗能力。因此免疫細胞培養(yǎng)至關(guān)重要。

                 

                為此,小愛創(chuàng)建了《免疫細胞培養(yǎng)攻略合集》,將為大家詳細地介紹免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程:樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。今天我們先一起學(xué)習(xí)樣本制備!

                 

                圖1 免疫細胞分化歷程及相關(guān)細胞因子(圖源網(wǎng)絡(luò))

                 

                除此之外,我們也要了解免疫細胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例,如此,我們才能選擇目的免疫細胞相對富集的樣本進行單細胞懸液的制備。以下列舉了人外周血,小鼠脾臟、外周血和淋巴結(jié)中免疫細胞的比例,供大家參考(表1和表2)。

                 

                表1 人外周血免疫細胞的比例

                 

                表2 小鼠脾臟、外周血、淋巴結(jié)免疫細胞的比例

                 

                實驗步驟

                 

                一、樣本制備預(yù)處理

                 

                在正式的樣本制備之前,我們還需進行樣本采集和預(yù)處理。根據(jù)目的免疫細胞的分化以及血液和免疫器官分布,選擇合適的樣本,新鮮取材,并進行相關(guān)的預(yù)處理。

                 

                血液:從血液中制備PBMC是分離特定免疫細胞亞群的一個常見方法。采集血液樣品后,要裝入含適當(dāng)抗凝劑的容器中防止凝集,并且血液要與抗凝劑充分輕柔混勻。不同的抗凝劑其抗凝原理略有不同,小愛也為大家整理了常見抗凝劑的原理及優(yōu)缺點(表3)。目前來說,適合后續(xù)免疫細胞培養(yǎng)的抗凝劑是肝素抗凝劑。

                 

                表3 常用抗凝劑匯總

                 

                實體組織:實體組織的預(yù)處理相對簡單,主要是組織的清洗。使用培養(yǎng)基或PBS等清洗組織上殘留的血液,并剔除相關(guān)的結(jié)締組織,整合過程中也一定要保證無菌。

                 

                注意事項:

                1)樣本的取材一定要新鮮無菌,這樣才能保證細胞的狀態(tài);

                2)血液要與抗凝劑輕柔混勻,劇烈晃動可導(dǎo)致溶血;

                3)血液采集后,需進行檢測以保證質(zhì)量及無菌。

                 

                二、樣本制備

                 

                樣本制備(Sample Preparation):免疫細胞的來源可分為血液和各種實體組織,由此,樣本制備的方法則分為PBMC的制備和實體組織制備成單細胞懸液。

                 

                1、單個核細胞(PBMC)的制備方法主要是密度梯度離心,其原理為血液中各細胞成分的比重存在差異,利用比重為1.077、近于等滲的人淋巴細胞分離液(Ficoll)作密度梯度離心時,各成分將按密度梯度聚集。

                 

                具體步驟如下:

                1)準(zhǔn)備無菌的15mL離心管或錐形管; 

                2)加入人淋巴細胞分離液(abs930)5mL。(注意:淋巴細胞分離液使用前需恢復(fù)室溫,18-25℃);

                3)Hank‘s液(abs9257)或PBS(abs962)緩沖液1:1比例(如果全血樣本粘稠,可適當(dāng)增大比例)稀釋抗凝過的全血樣品;

                4)小心沿著壁管,接近分離液層面,非常緩慢地加入新鮮的稀釋過的4mL全血樣品在淋巴細胞分離液上面(注意:切記不要攪渾淋巴細胞分離液);

                5)小心放進離心機(水平轉(zhuǎn)子),4℃離心25min,速度為500g,在此過程中升降速度降至1,避免產(chǎn)生細胞融合;

                6)小心取出離心管(切記不要震動),棄掉上層黃色的液體,吸取中間層的白色薄膜層,即為PMBC(如圖2);

                 

                圖2 抗凝血中加入Ficoll后圖示(左);離心分層后圖示(右圖)

                 

                7)用10mL PBS洗滌獲得的PBMC,離心10min,轉(zhuǎn)速250g,在此過程中升降速度降至1,避免產(chǎn)生細胞融合,棄上清;

                8)重復(fù)洗滌一次并重懸細胞備用。

                 

                注意事項:

                1)人淋巴細胞分離液(Ficoll)和血液(現(xiàn)取現(xiàn)用)在實驗前恢復(fù)至室溫(18-25℃為宜)并顛倒混勻,防止淋巴細胞分離液低溫時密度增加和紅細胞低溫時聚集,以減少PBMC被紅細胞污染;

                2)為保持淋巴細胞的活性,血液最好選取采血2h以內(nèi)的新鮮抗凝血液;如需對分離的淋巴細胞進行進一步的培養(yǎng)和檢測,請在采血和分離過程中注意無菌操作;

                3)稀釋或洗滌緩沖液,不可使用含鈣、鎂離子的緩沖液,以免導(dǎo)致血細胞凝聚;

                4)離心傾倒收獲細胞前,也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層,有助于減少細胞被血小板污染;

                5)過多吸取淋巴細胞白膜層以外的成分,會導(dǎo)致交界處的一些粒細胞或血小板等被混入;

                6)由于不同血液樣本間的差異,可能對分離效果產(chǎn)生影響。可根據(jù)實際情況適當(dāng)調(diào)整離心力和時間,參考離心力和時間范圍為:400-1000g、20-30min;

                7)將血液和淋巴細胞分離液混合一定時間后,出現(xiàn)紅細胞沉降屬于正常現(xiàn)象。

                 

                2、實體組織制備成單細胞懸液:傳統(tǒng)的實體組織解離成單細胞懸液的方法有機械法、酶解法和化學(xué)法。小愛也為大家整理了這三種方法的原理、適用范圍及優(yōu)缺點(表4)。

                 

                表4 組織制備單細胞懸液傳統(tǒng)方法的區(qū)別

                 

                聯(lián)合使用機械法和酶解法獲得單細胞懸液是很常用的方法,步驟如下:

                所需試劑、耗材、器械與儀器:

                試劑:DMEM培養(yǎng)基(abs9483),紅細胞裂解液(abs9101)

                耗材:1.5mL離心管(abs7119),15mL離心管(abs7120),50mL離心管(abs7121),一次性無菌過濾器(70µm)(abs7306)

                器械: 眼科剪、眼科鑷

                儀器:恒溫?fù)u床,離心機

                 

                操作步驟:

                1)取新鮮組織100mg左右加至無菌離心管中,用眼科剪將組織剪碎至1-2mm3 ,加入組織解離液(abs9482)1mL;

                2)將離心管置于恒溫?fù)u床上,37℃/180rpm震蕩孵育60min消化組織,可根據(jù)組織的不同適當(dāng)延長消化時間;

                3)孵育結(jié)束后將離心管內(nèi)的組織勻漿用70µm無菌過濾器過濾,然后加入細胞培養(yǎng)基沖洗無菌過濾器,用50mL的離心管收集濾液;

                4)將細胞懸液1200rpm離心5min,棄上清;

                5)再加入適量培養(yǎng)基,1200rpm離心5min,棄上清;

                6)用細胞培養(yǎng)基重懸細胞,取少量細胞鏡下觀察消化情況;

                7)根據(jù)需要將細胞用于后續(xù)實驗;

                8)(可選)可使用紅細胞裂解液去除組織解離過程中的紅細胞。

                 

                注意事項:

                1)組織解離液可根據(jù)實際使用量進行分裝,置于-20℃保存,隨用隨取,避免反復(fù)凍融;

                2)組織解離液2-8℃保存應(yīng)不超過48h,2-8℃長時間保存會降低產(chǎn)品的解離效果;

                3)若組織解離獲取的細胞用于細胞培養(yǎng),應(yīng)保證所有操作均在無菌條件下完成。 

                 

                實驗結(jié)果圖

                 

                適用于多種組織的解離,解離后細胞活率高。

                 

                abs9482將小鼠心臟組織處理為單細胞懸液后做流式:細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

                 

                abs9482將小鼠肝臟處理為單細胞懸液后做流式:細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

                 

                abs9482將小鼠腸道組織處理為單細胞懸液后做流式:細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

                 

                abs9482將小鼠脾臟處理為單細胞懸液后做流式:細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

                 

                abs9482將小鼠腫瘤組織處理為單細胞懸液后做流式:細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

                 

                今天講解就到這了,下一期我們講解細胞分選,大家如有細胞培養(yǎng)問題,歡迎后臺交流哦!

                  

                本期小愛推薦


                貨號

                產(chǎn)品名稱

                規(guī)格

                abs930

                人淋巴細胞分離液

                200mL

                abs9482

                組織解離液

                10mL

                 abs9101

                紅細胞裂解液

                100mL

                abs9241

                紅細胞裂解液(10×)

                100mL

                abs9483

                DMEM培養(yǎng)基

                500mL

                abs962

                PBS緩沖液(1×)

                500mL

                abs9257

                Hanks平衡鹽溶液(不含Ca2+,Mg2+,不含酚紅)

                500mL

                abs7306

                70um細胞篩網(wǎng)(200目,白色)

                100個/箱

                abs7119

                1.5mL離心管(無菌無酶)

                5000支/箱

                abs7120

                15mL離心管(尖底,無菌無酶)

                1200支/箱

                abs7121

                50mL離心管(尖底,無菌無酶)

                400支/箱

                abs7054

                25mL一次性血清移液管

                200支/箱

                abs7033

                細胞培養(yǎng)板(標(biāo)準(zhǔn)透明6孔板)

                50個/箱

                abs7011

                25cm2細胞培養(yǎng)瓶(50mL,透氣蓋)

                200個/箱




                 

                Absin產(chǎn)品線:

                爆款產(chǎn)品:試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測);細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠,胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒;分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒);化合物大包裝;輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...

                特色產(chǎn)品:雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...


                愛必信(上海)生物科技有限公司
                地址:上海市浦東新區(qū)新浩路58號申江科創(chuàng)園18棟
                郵箱:chenjw@absin.cn
                傳真:
                關(guān)注我們
                歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號了解更多信息:
                歡迎您關(guān)注我們的微信公眾號
                了解更多信息
                主站蜘蛛池模板: 120秒男女动态视频免费| 成年免费视频黄网站在线观看 | 日本xx18护土| 扒开粉嫩的小缝喷出水视频| 成人精品一区二区三区中文字幕| 无人在线观看视频高清视频8 | 亚洲色偷偷偷综合网| 亚洲欧美日韩中文在线制服 | 国产在线a不卡免费视频| 国产在线一区二区视频| 国产一精品一av一免费爽爽| 国产区精品福利在线社区| 国产69精品久久久久9999| 国产一级做a爱片久久毛片a| 国产亚洲色婷婷久久99精品| 嘿嘿嘿视频免费网站在线观看| 午夜dj免费在线观看| 亚洲精品视频久久| 亚洲av日韩av无码av| 久久精品一本到99热免费| 中国人免费观看高清在线观看二区 | 9277手机在线视频观看免费| 0588影视手机免费看片| 蜜桃av噜噜一区二区三区| 男男肉动漫未删减版在线观看| 欧美性a欧美在线| 日本中文字幕在线电影| 天天曰天天干天天操| 国产日韩欧美高清| 动漫人物将机机插曲3d版视频| 亚洲欧美成人一区二区三区 | 国产三级精品三级在专区| 伊人婷婷综合缴情亚洲五月| 亚洲一区第一页| 中文字幕一精品亚洲无线一区| a大片大片网y| jjzz日本护士| 老子影院理论片在线观看| 狠狠躁夜夜躁人人爽天天古典 | 女人脱裤子让男生桶的免费视频| 国产精品乱码在线观看|