免疫細胞培養(yǎng)攻略之樣本制備（一）

免疫細胞(immune cells)是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等，其在免疫細胞療法中扮演著至關(guān)重要的角色。免疫細胞療法，即通過采集身體中的免疫細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，擴增，最后回輸?shù)襟w內(nèi)，來增強機體對疾病的抵抗能力。因此免疫細胞培養(yǎng)至關(guān)重要。

為此，小愛創(chuàng)建了《免疫細胞培養(yǎng)攻略合集》，將為大家詳細地介紹免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質(zhì)量優(yōu)化、后續(xù)研究。今天我們先一起學(xué)習(xí)樣本制備！

圖1 免疫細胞分化歷程及相關(guān)細胞因子（圖源網(wǎng)絡(luò)）

除此之外，我們也要了解免疫細胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例，如此，我們才能選擇目的免疫細胞相對富集的樣本進行單細胞懸液的制備。以下列舉了人外周血，小鼠脾臟、外周血和淋巴結(jié)中免疫細胞的比例，供大家參考（表1和表2）。

表1 人外周血免疫細胞的比例

表2 小鼠脾臟、外周血、淋巴結(jié)免疫細胞的比例

實驗步驟

一、樣本制備預(yù)處理

在正式的樣本制備之前，我們還需進行樣本采集和預(yù)處理。根據(jù)目的免疫細胞的分化以及血液和免疫器官分布，選擇合適的樣本，新鮮取材，并進行相關(guān)的預(yù)處理。

血液：從血液中制備PBMC是分離特定免疫細胞亞群的一個常見方法。采集血液樣品后，要裝入含適當(dāng)抗凝劑的容器中防止凝集，并且血液要與抗凝劑充分輕柔混勻。不同的抗凝劑其抗凝原理略有不同，小愛也為大家整理了常見抗凝劑的原理及優(yōu)缺點（表3）。目前來說，適合后續(xù)免疫細胞培養(yǎng)的抗凝劑是肝素抗凝劑。

表3 常用抗凝劑匯總

實體組織：實體組織的預(yù)處理相對簡單，主要是組織的清洗。使用培養(yǎng)基或PBS等清洗組織上殘留的血液，并剔除相關(guān)的結(jié)締組織，整合過程中也一定要保證無菌。

注意事項：

1）樣本的取材一定要新鮮無菌，這樣才能保證細胞的狀態(tài)；

2）血液要與抗凝劑輕柔混勻，劇烈晃動可導(dǎo)致溶血；

3）血液采集后，需進行檢測以保證質(zhì)量及無菌。

二、樣本制備

樣本制備(Sample Preparation)：免疫細胞的來源可分為血液和各種實體組織，由此，樣本制備的方法則分為PBMC的制備和實體組織制備成單細胞懸液。

1、單個核細胞(PBMC)的制備方法主要是密度梯度離心，其原理為血液中各細胞成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近于等滲的人淋巴細胞分離液(Ficoll)作密度梯度離心時，各成分將按密度梯度聚集。

具體步驟如下：

1）準(zhǔn)備無菌的15mL離心管或錐形管； 

2）加入人淋巴細胞分離液(abs930)5mL。（注意：淋巴細胞分離液使用前需恢復(fù)室溫，18-25℃）；

3）Hank‘s液(abs9257)或PBS(abs962)緩沖液1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當(dāng)增大比例）稀釋抗凝過的全血樣品；

4）小心沿著壁管，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過的4mL全血樣品在淋巴細胞分離液上面（注意：切記不要攪渾淋巴細胞分離液）；

5）小心放進離心機（水平轉(zhuǎn)子），4℃離心25min，速度為500g，在此過程中升降速度降至1，避免產(chǎn)生細胞融合；

6）小心取出離心管（切記不要震動），棄掉上層黃色的液體，吸取中間層的白色薄膜層，即為PMBC（如圖2）；

圖2 抗凝血中加入Ficoll后圖示（左）；離心分層后圖示（右圖）

7）用10mL PBS洗滌獲得的PBMC，離心10min，轉(zhuǎn)速250g，在此過程中升降速度降至1，避免產(chǎn)生細胞融合，棄上清；

8）重復(fù)洗滌一次并重懸細胞備用。

注意事項：

1）人淋巴細胞分離液(Ficoll)和血液（現(xiàn)取現(xiàn)用）在實驗前恢復(fù)至室溫（18-25℃為宜）并顛倒混勻，防止淋巴細胞分離液低溫時密度增加和紅細胞低溫時聚集，以減少PBMC被紅細胞污染；

2）為保持淋巴細胞的活性，血液最好選取采血2h以內(nèi)的新鮮抗凝血液；如需對分離的淋巴細胞進行進一步的培養(yǎng)和檢測，請在采血和分離過程中注意無菌操作；

3）稀釋或洗滌緩沖液，不可使用含鈣、鎂離子的緩沖液，以免導(dǎo)致血細胞凝聚；

4）離心傾倒收獲細胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于減少細胞被血小板污染；

5）過多吸取淋巴細胞白膜層以外的成分，會導(dǎo)致交界處的一些粒細胞或血小板等被混入；

6）由于不同血液樣本間的差異，可能對分離效果產(chǎn)生影響。可根據(jù)實際情況適當(dāng)調(diào)整離心力和時間，參考離心力和時間范圍為：400-1000g、20-30min；

7）將血液和淋巴細胞分離液混合一定時間后，出現(xiàn)紅細胞沉降屬于正常現(xiàn)象。

2、實體組織制備成單細胞懸液：傳統(tǒng)的實體組織解離成單細胞懸液的方法有機械法、酶解法和化學(xué)法。小愛也為大家整理了這三種方法的原理、適用范圍及優(yōu)缺點（表4）。

表4 組織制備單細胞懸液傳統(tǒng)方法的區(qū)別

聯(lián)合使用機械法和酶解法獲得單細胞懸液是很常用的方法，步驟如下：

所需試劑、耗材、器械與儀器：

試劑：DMEM培養(yǎng)基(abs9483)，紅細胞裂解液(abs9101)

耗材：1.5mL離心管(abs7119)，15mL離心管(abs7120)，50mL離心管(abs7121)，一次性無菌過濾器(70µm)(abs7306)

器械: 眼科剪、眼科鑷

儀器：恒溫?fù)u床，離心機

操作步驟：

1）取新鮮組織100mg左右加至無菌離心管中，用眼科剪將組織剪碎至1-2mm³ ，加入組織解離液(abs9482)1mL；

2）將離心管置于恒溫?fù)u床上，37℃/180rpm震蕩孵育60min消化組織，可根據(jù)組織的不同適當(dāng)延長消化時間；

3）孵育結(jié)束后將離心管內(nèi)的組織勻漿用70µm無菌過濾器過濾，然后加入細胞培養(yǎng)基沖洗無菌過濾器，用50mL的離心管收集濾液；

4）將細胞懸液1200rpm離心5min，棄上清；

5）再加入適量培養(yǎng)基，1200rpm離心5min，棄上清；

6）用細胞培養(yǎng)基重懸細胞，取少量細胞鏡下觀察消化情況；

7）根據(jù)需要將細胞用于后續(xù)實驗；

8）（可選）可使用紅細胞裂解液去除組織解離過程中的紅細胞。

注意事項：

1）組織解離液可根據(jù)實際使用量進行分裝，置于-20℃保存，隨用隨取，避免反復(fù)凍融；

2）組織解離液2-8℃保存應(yīng)不超過48h，2-8℃長時間保存會降低產(chǎn)品的解離效果；

3）若組織解離獲取的細胞用于細胞培養(yǎng)，應(yīng)保證所有操作均在無菌條件下完成。 

實驗結(jié)果圖

適用于多種組織的解離，解離后細胞活率高。

abs9482將小鼠心臟組織處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠肝臟處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠腸道組織處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠脾臟處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

abs9482將小鼠腫瘤組織處理為單細胞懸液后做流式：細胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色結(jié)果

今天講解就到這了，下一期我們講解細胞分選，大家如有細胞培養(yǎng)問題，歡迎后臺交流哦！

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