6小時完成8指標染色？！mIHC技術大盤點

2022年，“生物大分子與微生物組"被列為國自然重點項目，由此掀起了空間蛋白組學技術的研究熱潮，其中免疫組織化學（IHC，Immunohistochemistry）作為最早的空間蛋白組學技術，衍生出了很多新興的研究方法。IHC是利用抗原-抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色以確定細胞內抗原，并對其進行定位、定性及定量的研究。

隨著空間蛋白組學技術的不斷發展，利用IHC進行的傳統多標記方案，也就是在連續切片上進行單標染色，很明顯已經不能適用于研究人員的高通量檢測需求。于是，mIHC技術就應運而生了，它可以做到在一個樣本中進行多重熒光染色。相比于傳統的組化技術，mIHC在復雜的腫瘤微環境中蛋白表達和共定位分析或其他生理過程中有較高應用價值，尤其是在樣本數較少的情況下，可以做到同時檢測多達10種熒光染料。

目前，mIHC有兩大技術——經典的TSA技術和新興的SignalStar技術。那么，這兩種技術我們該怎么去選擇呢？接下來就帶大家一起來看看吧～

Part 01 TSA技術簡介

1．TSA技術原理

酪氨酸信號放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技術，是利用辣根過氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 對靶蛋白進行高密度原位標記的酶學檢測方法。簡單來說，就是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯熒光素），來催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合；然后微波清洗，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，最后去檢測結果。

圖1 TSA技術原理圖

2. TSA操作步驟

1）使用TSA技術，你需要準備：嚴格驗證的高特異性抗體、HRP偶聯的針對一抗種屬亞型特異的二抗、酪胺熒光素、多光譜成像系統；

2）孵育一抗二抗：利用二抗上帶有的HRP催化后續添加入體系的非活性酪胺熒光素；

3）加入酪胺：酪胺熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合；

4）微波清洗：通過微波清洗去除已連接的一抗和二抗，共價結合的熒光素還留存在樣品上，再孵育新的靶點的一抗和二抗；

5）檢測：等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，使用熒光顯微鏡檢測結果。

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Part 02 SignalStar™ Multiplex IHC技術簡介

1.  SignalStar技術原理

SignalStar技術是使用帶有寡核苷酸標簽的特異性抗體，結合du有的信號放大系統并使用熒光成像檢測的多重免疫組化（mIHC) 技術，可在常規FFPE樣本中同時檢測3-8個靶標蛋白，且兼容常見下游成像平臺及分析軟件。

圖2 對石蠟包埋的人胃腺癌進行 SignalStar™ 多重免疫組化分析結果圖

2.  SignalStar操作步驟

1）將寡核苷酸偶聯的抗體加入到經過脫蠟，復水以及抗原修復處理的FFPE組織中；

2） 一次添加所有抗體，然后進行溫和固定；

3）互補寡核苷酸與前4個抗體的偶聯標簽雜交；

4）使用熒光寡核苷酸產生并放大信號(AF488, AF594, AF647, AF750)；

5）寡核苷酸連接；

6）寡核苷酸特異性酶去除所有熒光信號；

7）互補寡核苷酸與偶聯抗體上的寡核苷酸標簽進行第二輪雜交；

8）使用熒光寡核苷酸產生并放大信號(AF488, AF594, AF647, AF750)；

9）寡核苷酸連接。

圖3 SignalStar™實驗流程圖

Part 03 TSA 技術vs SignalStar技術

TSA技術與SignalStar技術各有優缺點，對比如下：

對于研究者來說，進行mIHC實驗需要準備抗體和多重熒光二抗試劑盒，可以提供4-7色的多色試劑盒及輔助試劑。除此之外，我們還可提供mIHC整體解決方案，包括試劑、服務等等。其中，愛必信多色服務最多九指標十色（含DAPI）的多重熒光免疫組化服務，樣本種屬涵蓋人、小鼠、大鼠、豬等；組織類型以腫瘤樣本居多，涵蓋肺、胃、肝、腎、腸等各大器官，甲狀腺、胰腺、唇腺、淚腺等各大腺體，另還有眼球、神經、大腦等特殊樣本；切片類型涵蓋石蠟切片、組織芯片（TMA）、冰凍切片、大組織切片、厚切片等，并提供全片掃描和定量分析。

圖4 Absin全景多靶點染色成像分析平臺

Part 04常見問題解答

Q1：波修復抗原每一輪染色都要做嗎？可以用抗體洗脫液替代嗎？抗體洗脫液用在哪個步驟？

A1：染第一個抗體之前做抗原修復，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識別到抗原；在染后面每一個抗體之前的抗原修復，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒有結合上的染料，其實更準確的叫法是“抗體洗脫"，也就是說第一次的抗原修復是真正的抗原修復，后面的抗原修復實際上是“抗體洗脫"，“抗體洗脫"可以用抗體洗脫液(abs994)替換，特別是細胞、冰凍切片或者骨樣本，但第一次抗原修復不能被抗體洗脫液替代，冰凍切片可以不進行抗原修復，染色效果欠佳時，可以考慮嘗試進行抗原修復，推薦冰凍切片快速抗原修復液(5×)(abs9207)。

Q2：脫蠟水合步驟中“10%中性福爾馬林浸片10min，滅菌水洗片1min，重復3次"目的是什么？我們以前做石蠟切片的時候沒有這一步。

A2：這是后固定的步驟，固定充分的組織可以省略此步。

Q3：做好的多色片子，無法進行及時掃描，該如何保存？

A3：需要避光防震，在4℃條件下保存。

Q4：樣本可以做成冰凍切片嗎？

A4：可以的。抗原修復步驟不推薦用加熱的方法，推薦用抗體洗脫液(abs994)

Q5：所有操作要避光嗎？

A5：不需要，在常規環境下操作就可以，染料的熒光強度很高。

Q6：抗體修復液每一輪修復都要更換嗎？

A6：是的，每一輪都要根據抗體選擇相應的修復液。

Q7：染料的選擇會影響后染色嗎，有共定位的話怎么辦？

A7：共定位的情況，我們可以通過單一通道觀察來更好的檢測各指標的分布情況，染料不會對染色有影響，串色的情況需要預實驗做充足，包括抗體稀釋比例，染料與放大液比例，修復條件的確定。

Q8：多色用的一二抗各是什么種屬？

A8：多色的優勢在于一二抗種屬無需特別要求，一抗根據樣本種屬選擇既可，二抗根據一抗選擇即可，多個抗體組合，種屬不會有影響。

Q9：抗體洗脫和微波修復哪種方式洗脫效果更好？

A9：微波修復洗脫更穩定，抗體洗脫液對大多數抗體都管用，難洗的抗體延長洗脫時間就可以啦！

Q10：我的組織還有GFP蛋白，給結果的時候能排除干擾嗎？

A10：可以的，結果分析的時候可以避免綠色通道，分析軟件賦予的顏色是偽彩色，可以更換其他顏色。

Q11：在指標與染料的搭配以及染色順序上，有什么規律嗎？

A11：并沒有一個特別的線性關系，和蛋白的種類、表達量以及修復條件都有關系，所以會多因素考慮，多嘗試，預實驗很重要。