分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)“酶”你不行！

做了這么多年的分子實(shí)驗(yàn)，對(duì)于其中的工具酶大家都了解嗎？他們的作用原理都知道嗎？本期Absin分子小課堂小愛(ài)要教大家如何分清這些復(fù)雜的酶。

工具酶是一類在DNA重組過(guò)程中，用于不同DNA分子的制備、切割、修飾、擴(kuò)增、核酸分子的標(biāo)記以及核苷酸序列測(cè)定的酶的統(tǒng)稱，是基因重組技術(shù)所需的工具。根據(jù)催化反應(yīng)特性可分為限制性內(nèi)切酶、聚合酶、連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等多種類型。

限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶主要從原核生物中發(fā)現(xiàn)，以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵，對(duì)外源性的DNA進(jìn)行切割、水解，被稱為“基因剪刀"。限制酶來(lái)源于細(xì)菌的“限制—修飾"系統(tǒng)，最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代末。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)與作用方式，可將其分為Ⅰ類限制酶(TypeⅠ)、Ⅱ類限制酶(TypeⅡ)和Ⅲ類限制酶(TypeⅢ)3種類型。其中，Ⅱ類限制酶識(shí)別切割位點(diǎn)比較專一，且不具有甲基化酶的活性，在DNA重組中被廣泛應(yīng)用。

愛(ài)必信擁有不同的TypeⅡ型限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品：

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

1、快速：5-15min內(nèi)即可完成酶切；

2、便捷：共用一種酶切Buffer，簡(jiǎn)化酶切體系；

3、兼容性高：在不同緩沖液中均具有很高活性；

4、良好酶活冗余度，輕松應(yīng)對(duì)底物過(guò)量或困難模板酶切。

DNA連接酶

DNA連接酶主要用于基因工程中，將由限制性核酸內(nèi)切酶“剪"出的粘性末端重新組，故也稱“基因針線"。作用原理為DNA連接酶催化雙鏈DNA鏈一條鏈上切口的連接，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-Po4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。T4 DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，可催化雙鏈DNA的粘性末端、平末端及RNA-DNA雜合體中單鏈的連接，在分子生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。

DNA聚合酶(DNA polymerase)

DNA聚合酶以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。實(shí)驗(yàn)室常用的DNA聚合酶有普通耐熱型Taq DNA聚合酶、高保真型DNA聚合酶。

逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶）又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA (complementary DNA, CDNA)。

核酸酶

核酸酶主要有三類，分別是：

1、脫氧核糖核酸酶(DNase)：DNase只能水解DNA的磷酸二酯鍵。胰DNasel可切割雙鏈和單鏈DNA，產(chǎn)物為5’-磷酸寡核首酸，牛脾DNasell降解DNA則產(chǎn)生3’-磷酸為未端的寡核苷酸；

2、核糖核酸酶(RNase)：將RNA降解為小片段的核酸酶；

3、非特異性核酸酶：將DNA、RNA都可進(jìn)行水解。

其他酶

FAQ：

1、限制性內(nèi)切酶無(wú)法切割DNA有哪些原因？

a. 內(nèi)切酶失活：用標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性；

b. DNA不純，含有SDS、酚、EDTA等內(nèi)切酶抑制因子：將DNA過(guò)柱純化，乙醇沉淀DNA；

c. 條件不適（試劑、溫度）：檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳；

d. DNA不存在該酶識(shí)別序列：換用其它的酶切割DNA或過(guò)量酶消化驗(yàn)證。

2、酶切后的DNA片段連接效率低？

a. 含磷酸鹽的濃度高：透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽；

b. 內(nèi)切酶失活或含有ATP酶：更換內(nèi)切酶；

c. 平末端連接：加大T4 DNA Ligase用量；

d. 連接緩沖液不合適：重新配制連接緩沖液。

3、脫氧核糖核酸酶I(abs60539)濃度、體積怎么換算？用于組織的解離該怎么用？

對(duì)于濃度、體積計(jì)算：本產(chǎn)品規(guī)格為1KU，酶活濃度是5U/mL，總體積則為200uL。根據(jù)說(shuō)明書最后一個(gè)表格計(jì)算酶體積用量：例如1ugRNA，相應(yīng)所需酶就是1U，1KU/1U=200uL/需要體積，最后計(jì)算得到0.2uL。對(duì)于動(dòng)物組織解離，可以適用，具體操作步驟及使用量可參考網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)。

4、pfAgo核酸內(nèi)切酶buffer是否含有金屬離子？

Buffer中不含金屬離子，對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)沒(méi)有任何影響。一般PfAgo酶可以兼容絕大多數(shù)PCR buffer，但普通Taq酶不兼容PfAgo buffer。

5、pfAgo核酸內(nèi)切酶和Ago核酸內(nèi)切酶（微球）有哪些差別？

兩者狀態(tài)不一樣、保存條件不一樣；檢測(cè)方法、使用的效果幾乎一樣。

名詞解釋：

酶活性單位：在一定溫度、PH及離子強(qiáng)度下，1h內(nèi)酶解（切割）特定底物DNA，所需酶的量。采用國(guó)際單位（IU，簡(jiǎn)寫為U）來(lái)統(tǒng)一表示酶活性的大小。

酶活性濃度：以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。目前幾乎都習(xí)慣用U/L來(lái)表示液體中酶活性濃度。

Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...