摘要：

盡管細(xì)胞外囊泡(EVs)在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用，但它們的不同種群及其分泌機(jī)制尚未表征：EVs如何以及在何種程度上形成為內(nèi)吞隔室腔內(nèi)囊泡(外泌體)或在質(zhì)膜(PM)上形成囊泡(ectosomes)仍不清楚。該研究跟蹤了EV標(biāo)志物CD9和CD63從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到它們的駐留區(qū)室，分別是PM和晚期內(nèi)體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。在它們最終分離之前，觀察到兩個(gè)地方的瞬時(shí)共定位。CD9和穩(wěn)定在PM的突變CD63在EV中比CD63更豐富地釋放。因此，在HeLa細(xì)胞中，ectosomes比外泌體分泌更多。通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析和對(duì)內(nèi)體pH中和的差異反應(yīng)，確定了一些可能對(duì)外泌體(LAMP1)或ectosomes(BSG、SLC3A2)具有特異性的表面蛋白。該研究工作為任何細(xì)胞類型中外泌體和小ectosomes的分子和功能區(qū)分開(kāi)辟了道路。

引言：

所有細(xì)胞都會(huì)在其環(huán)境中釋放膜包裹的囊泡，統(tǒng)稱為細(xì)胞外囊泡(EV)。這些EV包含來(lái)自其起源細(xì)胞的一組選定的脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)，因此可以將一系列復(fù)雜的信息傳輸?shù)街車蜻h(yuǎn)處的細(xì)胞。EV可以通過(guò)從原核和真核細(xì)胞的質(zhì)膜(PM)直接向外出芽形成。在真核細(xì)胞中，EV也可以首先作為內(nèi)吞途徑(MVB)的內(nèi)部多泡隔室的腔內(nèi)囊泡形成，然后在這些隔室與PM融合時(shí)分泌。為了闡明命名法，最近建議專門針對(duì)MVB衍生的EV使用術(shù)語(yǔ)“外泌體"，而不是針對(duì)所有小型EV；另一方面，PM衍生的EV被稱為各種名稱，例如微泡、微粒或胞外體。

由于它們?cè)诓煌膩喖?xì)胞位點(diǎn)形成，外泌體和胞外體可能包含不同組的特定貨物，因此具有不同的功能。然而，由于難以將生物流體或細(xì)胞條件培養(yǎng)基中存在的相同大小的外泌體與外泌體分離，缺乏區(qū)分外泌體與胞外體的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記，以及分子機(jī)制和具有對(duì)一個(gè)或另一個(gè)特異性的工具。

研究結(jié)果：

1、CD63和CD9存在于兩個(gè)不同的和一個(gè)共同的EV群體中

使用HeLa細(xì)胞去研究分析EV的分布，免疫熒光結(jié)果表明CD63主要位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。相反，CD9主要存在于質(zhì)膜上，但也存在于罕見(jiàn)的暗淡細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。在穩(wěn)態(tài)下沒(méi)有觀察到兩種蛋白質(zhì)的明顯共定位。

2、CD63和CD9短暫地通過(guò)晚期內(nèi)體和PM

pHluorin在酸性條件下實(shí)際上是無(wú)熒光的，但在中性pH時(shí)發(fā)出熒光，因此使其成為觀察酸性晚期胞內(nèi)MVB與質(zhì)膜融合的理想報(bào)告分子。由于細(xì)胞外部環(huán)境處于中性pH，因此在融合過(guò)程中會(huì)發(fā)生酸到中性的轉(zhuǎn)換。免疫電鏡表明在所有時(shí)間點(diǎn)，大多數(shù)MVB和溶酶體僅包含CD63而不是CD9。

3、與CD63不同，CD9和CD63-YA具有相似的PM定位和內(nèi)化動(dòng)力學(xué)

溶酶體靶向基序進(jìn)行突變?yōu)镃D63-YA，CD63-WT-eGFP或CD63-YA-eGFP RUSH質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞；結(jié)果顯示，在穩(wěn)定狀態(tài)下，與CD63-WT相反，CD63-YA主要位于細(xì)胞外圍和一些小的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。動(dòng)力監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，突變體CD63-YA 不會(huì)進(jìn)入酸性內(nèi)部隔間；同時(shí)，用生物素處理后，結(jié)果顯示CD9和CD63-YA在添加生物素后約1h達(dá)到相似的表面(AF647)/總(GFP)熒光強(qiáng)度比為1，在穩(wěn)態(tài)下進(jìn)一步增加至約2；相比之下，對(duì)于CD63，最大表面/總比值增加但保持低于1，直到添加生物素后2h，并在2h和穩(wěn)態(tài)之間下降，CD63-YA和CD9表現(xiàn)相似并在質(zhì)膜上積累。

4、PM蛋白在CD9-EV中富集，而內(nèi)體/溶酶體和PM跨膜蛋白都在CD63-EV中富集

為了更好地確定CD63+和CD9+EV的起源，并鑒定PM或內(nèi)體釋放的EV的特定標(biāo)志物，研究者進(jìn)行了定量質(zhì)譜分析；同步分泌的CD63或CD9 EV的定量質(zhì)譜分析揭示了質(zhì)膜和內(nèi)體衍生的EV的特征，PM蛋白在CD9-EV中富集，而內(nèi)體/溶酶體和PM 跨膜蛋白都在CD63-EV中富集。

研究結(jié)論：

這項(xiàng)工作旨在確定含有不同四跨膜蛋白的EV的實(shí)際外泌體或外泌體性質(zhì)。為了確定這些細(xì)胞釋放的EV的亞細(xì)胞起源，研究者通過(guò)時(shí)間控制的方式跟蹤四跨膜蛋白的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，從它們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的初始合成到它們?cè)贓V中的分泌。研究結(jié)果表明，CD63和CD9都可以在質(zhì)膜形成的小ectosomes中釋放，并且在HeLa細(xì)胞中，外泌體代表小EVs(sEVs)的一個(gè)小亞群，它們攜帶CD63和其他晚期內(nèi)體分子，如LAMP1/2。它們的分泌特別容易受到內(nèi)體pH值的中和。BSG和SLC3A2被鑒定為HeLa細(xì)胞中ectosomes分泌的特定標(biāo)記物，相反對(duì)內(nèi)體pH中和不敏感。有趣的是，CD81是另一種常用作外泌體和/或小EV標(biāo)記物的四跨膜蛋白，其行為類似于CD9而不是CD63。此處確定的外泌體與ectosomes的特異性標(biāo)志物和分子機(jī)制將為進(jìn)一步研究以破譯它們各自的功能鋪平道路。

參考文獻(xiàn)：

標(biāo)題：Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9

期刊：Nat Commun

發(fā)表時(shí)間：2021年

影響因子：17.694

本期小愛(ài)推薦：

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...