超超超詳細的組化二抗試劑盒說明書（解析版）

概念

免疫組化，免疫組織化學技術 (immunohistochemistry) ，是利用抗原抗體反應，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。

愛必信組化二抗試劑盒優點

圖 abs957即用型高效免疫組化二抗試劑盒

1、基于聚合物技術+一抗放大劑，高敏感性，一抗可再稀釋2-4倍！
2、非生物素檢測系統，更低背景！
3、快速便捷，更短孵育時間！
4、abs957單品文獻90+，認可度高！用的放心！

組分

額外準備一抗（來源于小鼠或兔子）、PBS 。

該試劑盒組分可用于50張片子，適用于一抗來源為小鼠和兔子的樣本（注意，不是樣本來源），DAB顯色。

實驗前準備

圖 樣本處理

1、取出固定好的樣本，流水沖洗3次，每次5min；

2、脫水、透明、浸蠟處理

75%乙醇(1h)——85%乙醇(1h)——95%乙醇(1h)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——63℃石蠟(50min)——63℃石蠟(50min)——63℃石蠟(50min)。

3、包埋處理

脫水結束后放入預熱的包埋機，按要求確定包埋方向進行包埋；

4、玻片做好編號標記；

5、切片：按照切片要求制備切片,切片厚度一般為3-5um；

6、攤片：用毛筆輕托放在46度水浴中攤片；

7、撈片、烤片：切片上組織充分展開后撈片，后置入60℃烘箱內進行烤片（（烤片時間視組織類型而定，一般組織30min即可，骨組織等要延長時間至1h）），之后便可以進行脫蠟。

操作步驟

圖 免疫組化實驗流程

說明：所有的步驟在室溫下操作，加試劑可以直接滴瓶滴定，也可以用移液器，一滴=30-40uL。

1、脫蠟、水化組織切片二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——100%乙醇(5min)——100%乙醇(5min)——95%乙醇(3min)——85%乙醇(3min)——75%乙醇(3min)——去離子水(5min)

2、PBS洗2-3次各5min；

3、抗原修復：根據所應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理；（抗原修復：將脫蠟好的切片置入抗原修復液（根據一抗說明書要求選擇用檸檬酸鈉或者EDTA），在高壓鍋內進行高溫抗原修復，高壓鍋加熱至飽壓，然后繼續加熱5min，關閉電源，10min后取出染色盒，室溫冷卻30min或者使用微波修復，將抗原修復完的切片組織周圍擦干，用組化筆畫上阻水圈）

4、PBS洗2-3次各5min；

5、內源性的過氧化物酶封閉：加入100uL A 液孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶，以減少非特異性背景染色；

6、PBS洗2-3次各5min；

7、血清封閉：加入100uL B 液孵育5min來減少非特異性染色。注意：此步驟不要超過10min；如果一抗在含有5％至10％正常山羊血清的緩沖液中稀釋，則此步驟可以省略。

8、PBS洗2-3次各5min；

9、一抗孵育：加一抗，室溫或37℃孵育20min，用量以浸沒樣本區域為準，可靈活調節；

10、PBS洗2-3次各5min；

11、一抗放大劑孵育：加入100uL C 液孵育10min；

12、PBS洗2-3次各5min；

13、二抗孵育：加入100uL D 液室溫或37℃孵育10min。注意：此液對光敏感，注意避光。

14、PBS洗2-3次各5min；

15、DAB試劑配制：配制新鮮底物液：將30uL的F液和1mL的E液充分混合，即配制成新鮮底物液（該底物液可存放2周）。

16、DAB顯色：加入100uL新鮮底物液, 孵育5min。注意：DAB顯色時間需要鏡下控制，選擇最佳顯色時間，做好防護。

17、終止顯色：去離子水沖洗；

18、復染：蘇木素復染3min左右、自來水沖洗，1%鹽酸酒精中分化1s，自來水沖洗；

19、脫水透明：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、兩次；

20、中性樹膠封片 蓋住玻片時從一端傾斜45°，小心不要產生氣泡。

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