疑難樣本 | FFPE樣本核酸提取指南

什么是FFPE樣本？

FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded，福爾馬林固定石蠟包埋) 樣本是將細(xì)胞、組織等放到固定液中，將固定后的細(xì)胞、組織置入由液體石蠟填充的容器中進(jìn)行保存的樣本，這樣處理能夠較長時(shí)間地保持細(xì)胞病理的原始狀態(tài)。

FFPE樣本可以用于常規(guī)的組織學(xué)分析，也可用于分子細(xì)胞的基因表達(dá)分析。FFPE樣本的基因檢測，指的就是利用FFPE樣本通過蒸餾、消化、DNA/RNA提取等細(xì)胞、組織分子技術(shù)，對樣本中DNA及RNA進(jìn)行檢測，以獲取相關(guān)基因表達(dá)在細(xì)胞進(jìn)行特定組織及生物過程中的功能及表型特征，為基因組學(xué)研究及深入了解腫瘤等領(lǐng)域研究具有很大的參考價(jià)值和應(yīng)用場景價(jià)值。

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FFPE樣本制備及核酸提取流程

圖 FFPE樣本制備及核酸提取純化流程圖

1、樣本采集

快速從病人身上獲取組織樣本。為避免組織離體后在外界環(huán)境中可能發(fā)生基因改變、組織自溶等變化，組織從獲取到固定之間的時(shí)間間隔控制得越短越好。

2、組織固定

將獲得的組織置于一定濃度（一般是10%）的福爾馬林溶液中。福爾馬林的作用是用于組織固定，這個(gè)過程會使蛋白質(zhì)之間、核酸之間、蛋白質(zhì)和核酸之間發(fā)生一定程度的交聯(lián)。此過程要注意把握組織的厚度，固定的時(shí)間。

3、石蠟包埋

將組織用石蠟進(jìn)行包埋。此過程包含：
1）脫水，使用醇類替換水；
2）透明，使用二甲苯替換掉醇類；
3）浸蠟，將組織浸入石蠟中，利用石蠟替換掉二甲苯；
4）包埋，將滲透后的組織樣本浸泡在液態(tài)石蠟中，連同包埋模具一起冰冷后固化，再切割為薄片后成為固定石蠟樣本，可長期保存或進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

4、核酸提取

FFPE樣本核酸提取的通用步驟為脫蠟、裂解-解交聯(lián)、純化、回收。具體步驟參照不同試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1）脫蠟

用手術(shù)刀片刮取玻片上的樣本至取樣管中，加入去蠟劑（環(huán)保浸蠟脫蠟透明液，abs9791）或二甲苯，在一定溫度中孵育進(jìn)行脫蠟暴露組織。

2）裂解-解交聯(lián)

利用裂解液與蛋白酶在一定溫度下進(jìn)行組織裂解與解交聯(lián)。

3）核酸純化

采用不同核酸純化方法純化DNA或者RNA。

4）回收核酸

利用洗脫液回收核酸。

圖 FFPE樣本核酸純化步驟

下面以愛必信的石蠟組織基因組DNA快速提取試劑盒(abs60019)為例具體介紹FFPE樣本DNA提取純化步驟。

1、產(chǎn)品組分信息：

2、自備材料

無水乙醇（第一次使用前請先在漂洗液 WB中加入適量無水乙醇，充分混勻）、2mL EP管、水浴鍋、離心機(jī)、渦旋儀

3、實(shí)驗(yàn)步驟

1）將組織切片4-5片，裝入到2mL EP管中，加入1.5mL SLI液，充分振蕩；
2）65℃水浴30min，再次充分混勻，12000rpm，4℃離心15min；
3）棄上清，再加入1mL SLI液，按以上步驟重復(fù)2-3次；
4）沉淀（組織）加入200μL裂解液TL和1mL SLⅡ溶液，加入20-50μL蛋白酶K，56℃水浴過夜；
5）觀察組織消化情況，如還有組織未消化完，加入10-20μL蛋白酶K，56℃水浴10-20min或直至組織消化完（期間可用渦旋充分振蕩混勻加速組織消化）；

注：也可用二甲苯進(jìn)行脫蠟，所需試劑需自備，具體操作步驟也可參考本試劑盒說明書—脫蠟方法二。

6）加入200μL結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10min；
7）冷卻后加入200μL無水乙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；
8）將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
9）加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm離心30sec，棄廢液；
10）加入500μL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇！），12000rpm離心30sec，棄掉廢液；
11）重復(fù)操作步驟10；
12）將吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；
13）取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加30-100μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置3-5min，12000rpm離心1min。為了增加DNA的回收率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。
注：DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

5、核酸質(zhì)控檢測

對于從FFPE樣本中提取的核酸，一般通過吸光度檢測儀器Nanodrop，熒光定量儀Qubit及毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行測定核酸濃度、OD值（純度）及片段大小(DIN)。對于核酸的質(zhì)控是非常重要的，因?yàn)樘崛〉暮怂豳|(zhì)量會影響下游的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本期產(chǎn)品推薦：

[1] Klopfleisch R, Weiss AT, Gruber AD. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol Histopathol. 2011 Jun;26(6):797-810. doi: 10.14670/HH-26.797. PMID: 21472693.

[2] 裴永彬,賀新奇,趙增仁.石蠟包埋組織中DNA提取技術(shù)研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(11):1396-1399.

好消息！Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級！

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...