生化檢測(cè)試劑盒 | 羥脯氨酸檢測(cè)與肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)估

背景介紹：

羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是蛋白質(zhì)和多肽前體的重要組成部分，是一種游離氨基酸，在體內(nèi)沒(méi)有代謝途徑，主要以原型經(jīng)尿排出，其生理功能與賴氨酸類(lèi)似，都是構(gòu)成氨基酸的一種重要成分。羥脯氨酸在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能，與體內(nèi)許多重要的生理活動(dòng)和病理變化密切相關(guān)，在哺乳動(dòng)物中，它僅存在于膠原蛋白和彈性蛋白中，但在植物中，許多蛋白質(zhì)都含有羥脯氨酸。人體中含有大量羥脯氨酸，它既是合成蛋白質(zhì)的原料，又是合成抗體和細(xì)胞因子等物質(zhì)的前體，多種疾病如腫瘤、炎癥等都會(huì)影響膠原蛋白更新，并可能導(dǎo)致血清或尿液羥脯氨酸升高。

羥脯氨酸檢測(cè)在肺纖維化中的應(yīng)用：

各項(xiàng)研究指示，膠原蛋白的過(guò)度沉積是纖維化疾病的主要特征，而羥脯氨酸（HYP）作為膠原蛋白所有的一種氨基酸，其含量約占膠原蛋白總氨基酸的13%，因此，采用比色法、 HPLC等生化方法測(cè)定組織中羥脯氨酸的總含量逐漸成為纖維化嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)常用的方法學(xué)，在2017年該方法學(xué)更是被美國(guó)胸科協(xié)會(huì)指南確立為肺纖維化臨床前評(píng)價(jià)的“金標(biāo)準(zhǔn)"。

2023年3月，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院陳永艷副教授團(tuán)隊(duì)在Immunity & Ageing期刊上發(fā)表了題為“UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fbrosis"的研究論文。本研究主要探討了老化的肺部容易受到慢性肺部疾病的影響，發(fā)現(xiàn)老化的呼吸道上皮細(xì)胞顯著上調(diào)子宮球蛋白相關(guān)蛋白1（UGRP1）的表達(dá)，從而導(dǎo)致衰老肺中CCL6水平升高，而肺泡巨噬細(xì)胞（AM）隨著衰老而發(fā)生本質(zhì)變化，表現(xiàn)出細(xì)胞數(shù)量減少和基因表達(dá)改變；UGRP1和MARCO+AM的上調(diào)參與了肺纖維化的進(jìn)展。因此UGRP1以CCL6依賴的方式調(diào)制與年齡相關(guān)的肺纖維化的MARCO⁺AM，是為老齡化人群建立最佳靶向的關(guān)鍵。

圖 運(yùn)用羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒abs580066對(duì)肺組織進(jìn)行檢測(cè)

羥脯氨酸含量檢測(cè)試劑盒：

另需自備的材料：酶標(biāo)儀（可讀取560nm處的吸光度）、蒸餾水、移液器與槍頭、研缽、離心機(jī)、高壓滅菌器、6mol/L HCl、10mol/L NaOH、酒精等。

操作步驟（以組織樣本為例）：

1、樣本處理：稱取1g組織于玻璃管中，加入1mL 6mol/L HCl，放入110℃烘箱中6~12h，離心機(jī)16000g 25℃離心20min，取上清液至新離心管中 ，然后加10mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。

2、試劑準(zhǔn)備：

1）Substrate：加入8mL Substrate Diluent溶解。（現(xiàn)配現(xiàn)用）
2）Dye Reagent：加入4mL Dye Reagent Diluent溶解。（現(xiàn)配現(xiàn)用）
3）標(biāo)準(zhǔn)品：加入1mL蒸餾水溶解Standard得到Standard①；從Standard①取10μL加入990μL蒸餾水中得到Standard②；取200μL Standard②加入800μL蒸餾水中，制備得到濃度為200μmol/L的Standard。

標(biāo)準(zhǔn)品二倍連續(xù)稀釋示例

3、上樣：
1）分別將40uL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加入相應(yīng)孔中，另設(shè)置空白孔加入40uL蒸餾水；
2）每孔分別加入80uL Substrate，混合均勻，室溫孵育20min；
3）每孔分別加入40uL Stop Solution，混合均勻，室溫孵育10min；
4）每孔分別加入40uL Dye Reagent，混合均勻，放入65℃烘箱中反應(yīng)20min，冷卻至室溫。

4、檢測(cè)與計(jì)算：使用酶標(biāo)儀測(cè)量560nm處的吸光度，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本濃度

注意事項(xiàng)：

1）對(duì)于未知的樣品，建議多做幾個(gè)稀釋梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；
2）試劑盒中的試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配好的溶液無(wú)法儲(chǔ)存，可能影響顯色讀數(shù)進(jìn)而影響檢測(cè)；如果樣本需要分批檢測(cè)，建議分批收樣儲(chǔ)存，待樣本收齊后統(tǒng)一檢測(cè)；
3）每次實(shí)驗(yàn)必須重新檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Absin生化檢測(cè)試劑盒——氨基酸代謝系列：

Chen Y, Hao X, Li M, Tian Z, Cheng M. UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fibrosis. Immun Ageing. 2023 Mar 18;20(1):14. doi: 10.1186/s12979-023-00338-8. PMID: 36934284; PMCID: PMC10024420.

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Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...