外泌體專題 | 樣本處理問題

外泌體概述：

外泌體是由活細胞分泌的，包含了復雜RNA和蛋白質，直徑在30-150nm的具有膜結構的小囊泡，現在特指直徑40-100nm的盤狀囊泡，主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等。

圖 外泌體示意圖

外泌體構成：

外泌體富含膽固醇和鞘磷脂，并攜帶有DNA、mRNA、microRNA、蛋白質、脂質以及一些代謝物，目前已經通過286項研究發現了41860種蛋白質、2838種microRNA、3408種mRNA。

外泌體功能：

1）介導信號轉導和分子轉移。作為多重信號顆粒，每個外泌體都有能力通過細胞表面同源受體的參與和聚集來傳遞多重組合信號，并且這種活性已被證明適用于參與生長因子、細胞因子、Wnt和Notch途徑的蛋白質。此外，外泌體與靶細胞的融合具有將功能受體傳遞給靶細胞的能力，在某些情況下甚至激活受體和效應物；
2）人類的生殖、懷孕和胚胎發育需要精確、精細和動態的細胞間通信。母乳來源的外泌體具有調節胎兒免疫系統的功能。在母乳中，外泌體不僅促進產后胎兒健康和生長，母乳來源的外泌體含有具備免疫相關功能的miRNA，并在體外增加外周血來源的T調節細胞的數量，可能調節免疫耐受；
3）調節免疫。外泌體的供體細胞來源多種多樣，如樹突狀細胞、抗原遞呈細胞甚至免疫細胞本身，且同一種細胞細胞在不同生理環境下分泌的外泌體功能不同，可促進免疫應答，也可免疫抑制；
4）外泌體與疾病。外泌體可能在代謝性疾病的出現以及心血管健康中發揮作用，已經發現它們可以轉移代謝產物，并通過小鼠和人類的胰腺b細胞、脂肪組織、骨骼肌和肝臟之間的外泌體miRNA交換促進細胞間通訊；外泌體可以參與錯誤折疊蛋白質的清除，從而發揮解毒和神經保護功能，進而在退行性疾病中發揮作用；與外泌體在其他疾病中的作用的研究相比，外泌體對癌癥的研究進展迅速，外泌體影響腫瘤形成、腫瘤生長和轉移、副腫瘤綜合征和對治療的耐藥性。

圖 外泌體與病毒感染

外泌體臨床應用：

1）疾病診斷。外泌體存在于所有生物液體中，由所有細胞分泌，使其作為微創液體活檢具有吸引力，并有可能進行縱向采樣以跟蹤疾病進展。外泌體診斷應用的焦點疾病包括心血管疾病、影響中樞神經系統（CNS）的疾病和癌癥；
2）載體制備。與脂質體相反，外泌體具有良好的耐受性，在小鼠外源性給藥時可以以最小的免疫清除率遞送功能性藥物；

3）治療作用。間充質干細胞衍生的外泌體可以發揮治療作用，并且在治療移植物抗宿主疾病患者中的應用表明，重復注射具有良好的耐受性，不會產生顯著的副作用。

外泌體研究中的樣本制備：

圖 外泌體研究中的樣本類型

外泌體研究中的樣本涉及血液、尿液、乳汁、唾液、腦脊液及細胞培養上清，整體的原則是去除細胞、新鮮樣本、低溫保存（-80℃）。

細胞培養上清液中外泌體提取和純化：

所需試劑：無外泌體胎牛血清（abs993）、細胞上清外泌體提取試劑盒（abs50040）、外泌體專用無血清培養基（abs9430）/外泌體專用無血清培養基（含生長因子）（abs9774）

圖 無外泌體胎牛血清 （abs993）

1）選取細胞狀態良好的代次，在細胞匯合度達到60%左右時，更換為無血清培養基（abs9430）或者含無外泌體血清（abs993）的培養基，繼續培養48h后，收集細胞上清液；
2）先用800~1000g左右的離心力10min有效去除細胞殘留，取上清后，再3000g離心10min有效去除細胞碎片物，去除細胞碎片的離心上清液轉移到新的50mL離心管中；
3）在去除雜質的離心上清液中加入Exosome Concentration Solution（ECS試劑），20mL上清液加入5mL ECS試劑；
4）加入ECS試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋振蕩器混勻1min，再放置于 4℃靜置至少2h；（增加靜置時間可提高外泌體得率，但靜置時間不可超過24h）
5）取出裝有混合液的離心管于4℃以10000g離心60min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）
6）外泌體重懸：取1×PBS均勻吹打離心沉淀物（具體加入劑量如下表），待其溶解后，將重懸液轉移至新的5mL離心管中；
7）將含有重懸液的5mL離心管于4℃以12000g離心2min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒；（注：若沉淀較多，可12000g/2min 離心多次至無明顯沉淀，每次取離心上清液）
8）純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉入Exosome Purification Filter（EPF柱）上室中，于 4℃以3000g離心10min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒；（注：EPF柱不可重復使用）

9）外泌體的保存： 純化后的外泌體以50-100μL進行分裝保存于-80℃低溫冰箱中，以備后繼實驗使用，外泌體保存液（2×）（abs9776），能夠將外泌體在4℃條件下保存至少6個月，適用于液態及凍干形態，能夠有效降低凍干對外泌體的負面影響。

注意事項：

1）在收獲細胞時，盡量保證死細胞數量不超過5%，因為凋亡、死亡的細胞會分泌凋亡小體，從而對活細胞產生的外泌體造成污染；
2）如果后期要將提取的外泌體進行共孵育或者動物實驗，需要用2um的濾器對外泌體進行除菌；
3）細胞上清樣品越早處理越好，長時間放置，含有的細胞破裂，胞內囊泡釋放也會對活細胞產生的外泌體產生污染；
4）不能用DMEM、1640、F12 這些基礎培養基替代血清或者外泌體專用無血清培養基呢，細胞在這些基礎培養基的環境下，是處于饑餓狀態的，細胞會將培養基中的營養物質全部消耗掉的，這時的上清液中的外泌體含量會大幅度下降。

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[1] Pegtel D M, Gould S J. Exosomes[J]. Annual review of biochemistry, 2019, 88: 487-514.
[2] Kalluri R, LeBleu V S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science, 2020, 367(6478): eaau6977.

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