干貨 | iPS誘導腦類器官培養攻略

腦類器官概述：

11月末，小愛曾為大家講述了3D類器官培養，相信大家對“類器官"及“3D培養"已不陌生。現階段，類器官的培養有多種不同的方法，而不同類器官的培養亦存在一定的差異，包括：視網膜、腸、甲狀腺、肝、垂體、大腦...等。

以人腦為例，因其具有高度復雜性，現如今，很多腦部疾病的研究很難在生物模型中開展，故體外模擬技術成為現在類器官培養領域的一項前沿技術。通常，研究人員可在體外環境中對大腦組織進行培育，模擬大腦發育過程，進而能夠觀察到人腦變化，為更深層次的腦部研究開拓思路。

接下來，小愛將為大家送上一份冬日秘籍：Nature protocol 技術干貨，為大家重點解析人腦類器官的培養過程。

ips誘導腦類器官流程：

圖1 大腦類器官培養流程

1、培育EB ● 1-2h

1）在六孔板的一孔中培育hESC或iPSC克隆，至匯合度為70-80％。一般而言，六孔板的一個孔可以產出大約整個96孔板所需的EB。

流程A，通過feeder依賴的PSCs培育EB；流程B，通過feeder非依賴的hESC培育EB。關鍵步驟：干細胞集落的形態對于腦組織形成的成功至關重要。菌落應無分化跡象，并應顯示多能性的最佳特征（圖2）。

feeder依賴的PSCs培育EB

圖2 人PSCs培育的大腦類器官發育進程

◆ 洗滌細胞，去除hESC培養基，加1mL不含鈣和鎂的D-PBS。后去除D-PBS，向6孔板的每個孔中加入1mL分散酶溶液，然后將細胞放回培養箱中孵育20-30min；
◆ 去除分散酶溶液，加入1mL低bFGF的hESC培養基。輕輕敲擊培養皿，以去除培養皿上的克隆而不移除MEF和已分化細胞。將含有完整克隆的培養基轉移至15mL錐形管，靜置約1min使得克隆沉降到試管底部；

◆ 輕輕吸出含有單細胞和MEF的上清液，注意不要干擾貼壁的細胞克隆。另添加1mL低bFGF的hESC培養基，再次使克隆沉降，后去除上清液；
◆ 將克隆重懸于1mL的胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚紅）中，并在37°C下孵育2min。加入1mL的胰蛋白酶抑制劑，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出現單細胞渾濁為止。取兩次5uL的細胞溶液進行計數，然后加入8mL低bFGF的hESC培養基；
◆ 在室溫下以270×g離心細胞5min，同時加入等體積的臺盼藍標記死細胞。使用血細胞計數器或自動細胞計數器對細胞進行計數。使用兩次計數的平均值；
◆ 首先將細胞重懸于含有ROCK抑制劑（1:100，終濃度50uM）的1mL低bFGF的hESC培養基中，多次吹打以確保混勻單細胞懸液。然后添加額外適量的帶有ROCK抑制劑的低bFGF的hESC培養基，以每150uL懸液獲得9000個活細胞；
◆ 低貼壁型的96孔板，每個孔中加入150uL懸液，后將其放回培養箱中。

feeder非依賴的hESCs培育EB

◆ 用1mL不含鈣和鎂的D-PBS洗滌細胞，并在六孔板的每個孔添加600uL不含鈣和鎂的0.5mM EDTA溶液，后將細胞放回培養箱中孵育4min；
◆ 輕輕吸出EDTA溶液而不干擾細胞克隆，后加入1mL的Accutase酶。將細胞放回培養箱中孵育4min；
◆ 采用1mL的mTeSR1培養基吹打細胞克隆，使其與培養皿分離。取其中2mL轉移到15mL錐形管中，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出現單細胞渾濁為止。取兩次5uL的細胞溶液進行計數，后添加3mL mTeSR1培養基并混合均勻；
◆ 在室溫下以270×g離心細胞5min，同時加入等體積的臺盼藍標記死細胞。使用血細胞計數器或自動細胞計數器對細胞進行計數。使用兩次計數的平均值；
◆ 首先用1mL含ROCK抑制劑的低bFGF的hESC培養基（1:100，終濃度50uM）重懸細胞，多次吹打以確保混勻單細胞懸液。然后添加額外適量的帶有ROCK抑制劑的低bFGF的hESC培養基，以每150uL懸液獲得9000個活細胞；
◆ 低貼壁型的96孔板，每個孔中加入150uL懸液，后將其放回培養箱中。

2、培育EBs，啟動細胞層分化 ● 5-7d

圖3 不同培養階段類器官形態

2）培育24h后在組織培養顯微鏡下觀察細胞板，可在鏡下觀測到邊界清晰的小規模EB。繼續在組織培養箱中于37°C、5％CO2條件下培養EB；
3）每隔一天輕輕吸去大約一半體積的培養基，注意不能干擾底部的EB，添加150uL新鮮培養基（最終體積>150uL即可，具體的量并不重要）。加入ROCK抑制劑（1:100）和低bFGF培養基（4ng.mL-1），直到EB開始變亮或直徑大于350-400um。可以使用配有照相機和測量軟件的倒置顯微鏡進行尺寸測量。一般而言，在前4天添加ROCK抑制劑和低bFGF培養基。

4）當EB的直徑達到350-600um，按照步驟3中所述更換培養基，但不添加ROCK抑制劑和bFGF。

3、誘導原始神經上皮細胞 ● 4-5d

5）當EB的直徑達到500-600um，并且開始變亮、產生平滑的邊緣時（通常是第6天，可見圖2b和3），將每個EB用200uL移液槍頭切面切下，移至低附貼壁型的24孔板中，每孔提前加入500uL神經細胞誘導培養基（圖1），注意不要破壞EB。關鍵步驟：用無菌剪刀裁剪200uL移液器槍頭，以獲得直徑1–1.5mm的開口。確保開口不要太小（會破壞EB），但也不要太大（將很難將EB吸到移液器吸頭中）。請勿嘗試使用刮刀或其他工具將EB從培養板中移出（會破壞EB）。
6）將EB轉移至24孔板48h后，再添加500uL神經細胞誘導培養基。
7）繼續培育2天后，在組織培養顯微鏡上觀察EB。此時EB周圍應該更亮，表明出現神經外胚層分化。一旦這些區域開始顯示與神經上皮分化所一致的假分層上皮放射狀的形態（圖2c）（應在神經誘導培養基中培養4-5d后發生），繼續進行步驟8，將細胞聚集體轉移至基質膠液滴（圖1） ）。重要步驟：健康的細胞聚集體應該具有光滑的邊緣。神經上皮在外表面發育，并且在光學上是半透明的（圖2c和3c，d）。關鍵步驟：當神經上皮出現時，請務必及時進行步驟8，將組織轉移至基質膠。不要過早轉移組織，否則會影響后續腦組織培養的形態。

4、將神經上皮組織轉移到基質膠液滴中 ● 1-2h

8）將基質膠放于4℃冰箱過夜融化。
9）制作用于制備基質膠液滴的帶凹痕封口膜。裁剪一塊正方形的封口膜，放置在200uL槍頭盒凹痕處，戴手套以摁壓封口膜，使其形成一個個小的凹槽。
警告：因為不能對封口膜進行高壓滅菌，因此在準備之前，請確保在清潔的環境中使用封口膜，并用70％（體積/體積）的乙醇對手套和封口膜進行滅菌處理。在此步驟時，培養基中還應包含抗生素以防止污染。
10）制作一個包含4×4凹槽的封口膜（總共16個凹槽），并用無菌剪刀將封口膜修剪成一個小正方形。將正方形封口膜放入60mm的組織培養皿中。關鍵步驟：4×4的封口膜大小適合于60mm的組織培養皿。因此，每個60mm培養皿中總包含16個基質膠液滴。
11）使用剪切好的200uL移液槍頭，將神經上皮組織逐個轉移到封口膜的每個凹槽中。關鍵步驟：同第5關鍵步驟。
12）用完整的200uL移液槍頭頂部小心吸出液體，以去除每個組織中多余的培養基。
13）每個組織滴加約30uL的基質膠液滴，充盈整個凹槽，浸潤組織。關鍵步驟：添加基質膠需迅速，避免組織變干。
14）使用10uL移液槍頭將每個組織移置于基質膠液滴的中心（圖2d）。關鍵步驟：添加液滴后必須立即進行此步驟，基質膠在室溫條件下便會開始凝固。
15）將裝有基質膠液滴封口膜的60mm培養皿，放回37°C培養箱，孵育20-30min以使基質膠聚合。
16）在60mm培養皿中加入5mL不含維生素A的腦類器官分化培養基。
17）使用無菌鑷子將封口膜翻轉過來，基質膠滴浸潤在培養基中，再攪動培養基使得所有基質膠滴都從封口膜上脫離下來。繼續在二氧化碳培養箱中培養組織液滴。

5、神經上皮芽的固定培養 ● 4d

18）培育24h后在顯微鏡下觀察基質膠包埋的組織。組織應在1-3d內開始形成更多向外擴張的神經上皮芽，其中含有充滿液體的空腔（圖2e和3f）。
19）繼續孵育組織24h，然后用不含維生素A的腦類器官分化培養基培養含有神經上皮組織的基質膠滴，在不攪拌的情況下孵育48h。關鍵步驟：傾斜培養皿，使液滴下沉，并小心吸出培養基，吸取盡可能多的培養基而不干擾基質膠滴，每次采用5mL新鮮培養基替換。

6、腦組織的生長 ● 1 year

20）靜態培養4d后，使用剪切開的1mL移液器吸頭（開口約3mm）將培養的類器官轉移至125mL的可旋轉器官培養瓶中（圖1），在75-100mL含有維生素A的腦類器官分化培養基中進行培養。器官培養瓶可以放在培養箱中配套的磁力攪拌板上（圖2f），也可以放在培養箱中配套的搖床上（振動速度為85rpm）。只需將每個60mm培養皿中的培養基替換為含有維生素A的腦類器官分化培養基，然后將培養皿放入培養箱中培養即可。關鍵步驟：不要轉移過多的類器官（小于32個），過多的數量會導致類器官融合；確保使用驗證應用于組織培養的培養箱低速攪拌板。
21）如步驟9所述，全量更換培養基，搖床培養時每3-4d更換，旋轉培養瓶每周更換，并實時監測類器官的形態。

Lancaster M A,Knoblich J A.Generation of Cerebral Organoids from Human Pluripotent Stem Cells[J].Nature Protocols, 2014, 9(10):2329-2340.

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