免疫細胞專題 | NK細胞

NK細胞概述：

自然殺傷（nature killer，NK）細胞屬于天然淋巴樣細胞家族，在人類中通常被定義為CD3^- CD56⁺細胞，占循環淋巴細胞的5%～15%。NK細胞是抵御病毒感染和細胞突變的第一道防線，無需預先致敏就能殺死威脅宿主的癌細胞、異體細胞和外來病原體感染的細胞，被認為是癌癥免疫監測、移植排斥和早期病毒免疫的關鍵效應細胞。

圖 NK細胞（黃）和癌細胞（紅）

NK細胞免疫療法：

CAT免疫療法的成功激發了研究者們利用其他免疫細胞進行癌癥治療的興趣，簡單的說細胞免疫療法就是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養，使其數量倍增，然后再回輸到人體，一方面用來消除癌細胞、突變細胞，另一方面激活和增強機體免疫力，控制癌細胞的轉移和復發。與CAT-T療法相比，NK療法可以靶向多種致病性抗原，具有更強的細胞毒性，且不分泌引發細胞因子釋放綜合征（CRS）的主要細胞因子，可以極大地減輕不良反應的風險，被寄予厚望。

NK細胞治療的主要策略：

體外活化的自體或異體NK細胞、NK細胞和單抗藥（如免疫檢查點抑制劑）聯合來誘導抗體特異的細胞毒性（如：抗EGFR的西妥昔單抗）、CAR-NK細胞免疫療法等等。

目前尚未有NK細胞療法上市，但其臨床試驗如火如荼，截止11月份clinicaltrials網站上，關于“NK Cell"的搜索結果已高達720例，目前在NK細胞療法在已經在急性髓細胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生異常綜合征、神經母細胞瘤、以及胃癌、肝癌、肺癌、腸癌等實體瘤的治療中表現出良好的治療效果。

圖 clinicaltrials中“NK Cell"的搜索結果

體外擴增的NK細胞來源：

NK細胞除了從自體或異體的外周血分離獲得，還可以來源于臍帶血、干細胞分化等，此外，由于以上三種方式獲得細胞的繁瑣，在CAT-NK的研究中，不少研究者使用NK-92進行進一步的修飾，臨床前研究已經取得了較好結果，值得注意的是，需要在輸注前對細胞進行輻射。

人外周血NK細胞的分離純化方案：

準備：15mL離心管（abs7102）或錐形管、Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）、人淋巴細胞分離液（abs930）。

圖 愛必信人淋巴細胞分離液（abs930）

1、獲取PBMC

1）準備無菌的15mL離心管或錐形管；
2）加入淋巴細胞分離液5mL；（注意：淋巴細胞分離液使用前需恢復室溫，18-25℃）
3）Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）緩沖液1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當增大比例）稀釋抗凝過的全血樣品；
4）小心沿著壁管，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過的4mL全血樣品在淋巴細胞分離液上面；（注意：切記不要攪渾淋巴細胞分離液）
5）小心放進離心機（水平轉子），4℃離心20-30min，速度為400g-1000g；（注意：離心機剎車應取消，需等待自然停止）
6）小心取出離管，切記不要震動；
7）可見上層為淡紅色透明血漿，其次為薄薄的致密白色環，為PBMC；
8）吸棄上清后，將白膜層輕輕地吸出來轉移到新的離心管中；
9）用PBS重懸，室溫，300g離心10min，重復操作2次，棄去上清，用少量PBS重懸。

2、NK細胞的純化

NK細胞純化常用的方式是磁珠分選，包括陽性分選和陰性分選兩種，人NK細胞發育階段主要基于CD34、CD117、CD56和CD94的表達水平。CD56表達增加是NK成熟的關鍵，CD56+和CD16+可以鑒別和分離不受其他淋巴細胞污染的NK細胞。此外，白細胞介素2/15受體β（CD122）也是NK細胞發育后期的重要標志。

3、NK細胞培養

1）將純化后的NK細胞用免疫細胞無血清培養基（abs9772）重懸，按照一定密度接種于培養皿或培養瓶中。

2）在免疫細胞無血清培養基中添加100-200IU/mL的IL-2，確保NK細胞的增值和活化并有助于提高細胞毒性，與IL-15聯合應用可促進NK細胞的增殖，有利于NK細胞的激活。 

3）將細胞置于37℃的培養箱培養至少48h，再進行后續細胞功能鑒定等實驗。

名詞通解：

陽性篩選：磁珠結合需要篩選細胞的表面標志物，達到純化目的。

陰形篩選：通過磁珠結合等手段除去混合物細胞中除目的細胞之外的其他細胞，以達到純化目的。

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[1] 米錦濤;袁成良.NK細胞相關免疫檢查點及其抑制劑的研究進展[J].現代腫瘤醫學,2023,31(24):4645-4650.
[2] Shimasaki N, Jain A, Campana D. NK cells for cancer immunotherapy[J]. Nature reviews Drug discovery, 2020, 19(3): 200-218.

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