探究環狀RNA在疾病治療中的應用前景

環狀(circRNA)是一類特殊的共價閉環RNA分子，在調控生理和病理進程中，通過不同的機理發揮著重要作用。傳統上，circRNA被認為是一種非編碼RNA(ncRNA)。2014年，在北卡羅來納大學報導了環形RNA在細胞內可通過非帽依賴的機理來翻譯蛋白，人們認識到circRNA也具有編碼與表達蛋白的能力。此后，隨著體外環化技術的發展，比線性mRNA穩定性更強的合成circRNA成為mRNA治療領域備受關注的新技術，有望以mRNA藥物相似的遞送方法，實現疾病的治療。

圖1 環狀RNA結構

一、circRNA的特點

1、強穩定性：與線性RNA相比，circRNA的主要優勢就是其環狀結構提高了穩定性。因為circRNA中5’和3’末端的缺失使其具有外切酶抗性，不能通過典型的RNA降解途徑降解，需要通過核酸內切酶線性化后將其降解（圖2，a-c），因此，具有更高的體內穩定性，半衰期更長。

圖2 circRNA的降解和翻譯

2、非帽依賴性翻譯：大多數真核生物mRNA的翻譯起始于5’端，以典型的帽(7GpppN)依賴方式進行（圖2，d），由于步驟復雜且需要招募較多起始因子，該過程具有高能量消耗的特點，因此，當機體處于病毒感染或疾病等細胞應激的不利條件下，該典型翻譯起始將被整體抑制，以確保細胞響應應激并存活。那么當典型翻譯機制下調時，維持細胞生存所需要的關鍵蛋白的產生就需要另一套非典型翻譯機制，即非帽依賴性翻譯—通過內部核糖體進入位點(IRES)來驅動，而這種非帽機制正適合無5’端的circRNA，已知IRES是circRNA主要的翻譯方式。換言之，在疾病治療過程中，當機體處于ER應激、遺傳毒性應激、缺氧、營養剝奪、體溫過低、體溫過高或感染狀態下，帽依賴性翻譯起始被抑制，線性mRNA無法有效翻譯，基于mRNA的藥物療效降低，而circRNA可憑借非帽依賴性翻譯的機制優勢，保證蛋白質的正常翻譯，保證藥物療效。

3、多順反子表達：多順反子表達是指從單個mRNA分子中翻譯兩個或多個獨立的基因。對于多順反子線性mRNA，5’cap比IRES的表達更高，導致蛋白表達比例不均。而對于circRNA，通過引入多個IRES-ORF，有可能達到接近化學計量的多順反子表達，因為所有編碼的蛋白質都具有相同的翻譯起始機制。雖然這一點尚未得到證實，但circRNA的多順反子表達可能有益于多組分蛋白質療法，其中蛋白質復合物組分的受控比例至關重要。

4、免疫原性低：線性RNA通過病原體識別受體（如RIG-I、TLR3、TLR7、TLR8等）刺激先天免疫，導致干擾素反應，進而對其翻譯及應用造成了負面影響；而純的circRNA并不存在RIG-I、TLR3、 TLR7及TLR8的識別序列，這種“免疫沉默(immunosilent)"可以使其更有效地表達蛋白質，而沒有抑制性干擾素反應。此外，先天免疫系統激活減少限制了樹突狀細胞的活化和成熟，有助于防止對編碼的治療蛋白產生免疫力。

二、circRNA的應用

1、蛋白質替代療法

蛋白質替代療法的目的是恢復那些缺失或有缺陷的蛋白質功能，通常是由基因突變導致。采用mRNA治療內源蛋白缺失已應用于多種疾病

相對于mRNA，circRNA在蛋白替代療法的應用中具有諸多優勢，如結構具有更高的穩定性，蛋白質表達時間更長；具有與線性RNA相似的蛋白表達峰值，但下降率較低。這些優勢使得circRNA可以產生較高的蛋白質累積并持續較長時間；減少給藥頻率，且免疫原性較低。

2、疫苗

mRNA疫苗具有高效、研發周期短、模塊化生產、低成本等優勢，已是通用的疫苗種類，尤其在應對新冠等突發流行病，其極快的研發制造能力，優勢極為顯著。同時，在面對病毒變異方面，多價mRNA疫苗的易得性可及時提供針對多種病原體的保護，意義重大。

另外，mRNA疫苗的自佐劑效應也為疫苗保護性免疫的誘導提供了支持。在機制上，mRNA會引起與病毒免疫相關的Th1偏向免疫應答，誘導對T細胞擴增和免疫記憶形成至關重要的I型干擾素反應，對病毒預防極有幫助。不過該機制同時也限制了mRNA的帽依賴性翻譯起始，影響表達效率。那么circRNA所使用的非帽依賴性起始機制，例如不受干擾素抑制的IRES，是一種有吸引力的替代方案。在保持circRNA抗原表達穩定的同時，更有效地誘導干擾素反應，可能會進一步增強疫苗的保護作用。

疫苗接種的目標是誘導強烈的適應性免疫反應和長期免疫記憶。適應性免疫記憶的誘導部分取決于抗原暴露的持續時間。因此，RNA編碼抗原的長期表達可以更有效地引發具有持久免疫記憶的免疫反應 。與mRNA相比，circRNA固有的穩定性延長了蛋白質翻譯的時間，增加了體內的蛋白質產量，長期表達抗原可以更有效地誘導具有持久免疫記憶的免疫反應。

3、癌癥免疫療法

癌癥免疫治療采用機體免疫的作用成分如細胞因子、抗體和免疫細胞等進行癌癥的治療。基于RNA的免疫治療可以通過將癌癥新抗原編碼為疫苗、免疫刺激細胞因子、抗體和免疫細胞受體實現，具有靈活性及多功能性。此外，還可以通過非病毒載體以mRNA直接轉染T細胞，在體原位生產CAR-T細胞，避免了傳統CAR-T細胞制造的缺點。

circRNA在癌癥免疫治療中有幾個優勢：

1）與mRNA相同，circRNA既可應用于腫瘤個性化治療，也可同時編碼多種新抗原，降低癌癥逃逸和復發風險。對于精準細胞治療，可以通過改變編碼序列輕松定制嵌合抗原受體的circRNA編碼，并定制以靶向不同類型的癌癥進行精準癌癥免疫治療；

2）circRNA的穩定性強，可以保證抗原蛋白的穩定表達；circRNA癌癥疫苗可以延長抗原呈遞，獲得更強的免疫反應；增加免疫刺激蛋白，如細胞因子和小抗體片段的表達時間，可以更好地將免疫細胞招募到腫瘤部位；

3）早期研究表明，修飾mRNA的低免疫原性對腫瘤中的蛋白質表達很重要，因此circRNA固有的較低免疫原性對于腫瘤內免疫刺激蛋白表達更具優勢。未修飾的RNA激活先天免疫系統將降低抗體表達，阻止適應性免疫細胞有效募集到腫瘤中；

4）由于IRES啟動的非帽依賴性翻譯既可適應各種復雜的腫瘤環境，也可抵抗癌細胞減緩蛋白翻譯并逃逸細胞因子或抗體免疫治療機制，增加了不同癌癥治療的一致性。

4、基因編輯

在基因編輯方面，基于circRNA的穩定性，首先可應用于小的RNA組分，比如向導RNA(adRNA/gRNA)，因為在基因編輯系統中的向導RNA是最脆弱的，很容易被核酸酶降解；其次，circRNA也有望用于編碼基于蛋白質的編輯器以進行基因編輯。與mRNA相比，circRNA提供的穩定性和穩健表達可以使Cas9蛋白的持久性更長，增加的蛋白表達可能會顯著提高基因編輯效率。

在ADARs介導的RNA編輯中，2019年，北京大學魏文勝課題組曾研發出了借助gRNA募集ADAR實現RNA精準編輯的新策略^[1]：LEAPER™。LEAPER™通過在細胞中表達短工程化的ADAR募集RNA(ADAR-recruiting RNA，arRNA)來完成ADAR的招募以及RNA編輯，由于這種技術彼時尚不成熟，具有一定長度的arRNA可能引起鄰近的堿基的脫靶編輯。2022年，魏文勝課題組推出了LEAPER™的升級版本—— LEAPER™ 2.0，設計并運用了可招募ADAR的環形RNA(circular ARAR-recruiting RNA，circ-arRNA)^[2]，通過AAV遞送，遺傳編碼的circ-arRNA可以在人的原代細胞和類器官中實現長時程的RNA編輯，這種可避免核酸外切酶切割的環狀RNA進一步提升了體外和體內編輯的效率和精準性，基本清除了雙鏈RNA區域內目標轉錄本上的脫靶。

5、非編碼環狀RNA治療

circRNA在細胞內具有內源性非編碼功能，如miRNA和RNA結合蛋白海綿功能。circRNA作為調控RNA，具有作為miRNA和RNA結合蛋白的競爭性抑制劑從而進行治療的潛力。不過目前已有研究都處于體外實驗階段，尚未有體內數據，不過受限于遞送問題，體內模型可能也難以實現。

circRNA是共價封閉的、高度穩定的RNA形式，具有巨大的治療應用潛力。與線性蛋白相比，circRNA具有穩定性和蛋白質表達增強的能力等優點，在疫苗開發、癌癥免疫治療、蛋白質替代治療和基因編輯方面有著廣闊的可應用空間。總之circRNA在基于RNA的藥物領域是一種有潛力的RNA形式，有望更新個性化治療手段。

[1]Yi, Z., Zhu, S., et al. (2019). Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nature biotechnology, 37(9), 1059–1069. 

[2] Yi, Z., Qu, L., Tang, H. et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 40, 946–955 (2022). 

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