類器官免疫共培養實驗方法

近年來，腫瘤免疫療法在癌癥治療中非常火熱。腫瘤免疫學治療的目的是激發或調動機體的免疫系統，增強腫瘤微環境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細胞。隨著免疫治療的興起也推動了腫瘤研究的發展，但是由于人源化體系的復雜性、免疫系統的部分或無效重組建等問題，致使免疫腫瘤模型面臨著巨大的挑戰，臨床上迫切需要能夠用于個體化驗證療效的體外模型。類器官的出現給腫瘤免疫治療提供了新的契機，然而，現有的類器官中缺乏免疫細胞限制了其發展。

小愛這次給大家介紹一下基本的腫瘤類器官免疫共培養方法，如下：

1、類器官準備

1）提前一周，復蘇培養類器官至狀態良好；

2）取合適數量類器官，使用預冷PBS清洗數次，去除大部分基質膠；

3）使用培養基重懸類器官。

2、PBMC分離和類器官共培養

1）外周血在無菌環境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集，運輸保存；

2）將新鮮靜脈血與PBS緩沖液1：1稀釋，輕輕混勻待用；

3）添加4ml細胞分離液（abs930），緩慢加入靜脈血混合物8ml，靜置待用；

4）2000rpm離心20min，在此過程中升降速度降至1，避免產生細胞融合；

5）此時觀察到15ml離心管為4層，輕輕吸取第2層白色懸浮物于15ml離心管，混勻待用；

6）1500rpm離心10min，在此過程中升降速度降至1，避免產生細胞融合，棄上清；

7）添加適量T細胞無血清基礎培養基靜置培養觀察。T細胞無血清培養基的配置：向T細胞無血清基礎培養基里添加IL-2（abs05543）200-500單位/ml（刺激T細胞生長與增殖），CD3/CD28磁珠（abs160019）3ug/ml（激活T細胞）；

8）使用T細胞無血清培養基，懸浮調整至合適濃度，96孔板，每孔約加入5*10⁵ 活T細胞，100ul體積；

9）重懸類器官混合液，分別加入等量的樣至96孔板中，至總體積200ul。

3、培養觀察

1）D0觀察記錄類器官和T細胞狀態；

2）37℃，5% CO₂條件下培養，每日連續觀察；

3）D3吸出100ul培養上清，加入100ul新培養基，同時加入（處理抗體或藥物）使至終濃度100nM（如果D3已出現顯著差別，則記錄大視野明場形態，終止實驗）；

4）觀察至實驗組間差異顯著，拍照記錄大視野細胞明場形態；

5）細胞上清保存用于后續檢測。

此圖為我司做得免疫共培養實驗，從上圖可明顯看出B藥物作用下，T細胞有明顯的殺傷效果。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎公眾號“愛必信生物"后臺留言哦！

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