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                實(shí)驗(yàn)小白來集合!染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)流程與常見問題

                更新時(shí)間:2023-09-14      點(diǎn)擊次數(shù):1496

                染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)的原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

                 

                一、細(xì)胞交聯(lián)與裂解


                在裝有20ml生長培養(yǎng)基的150mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,長到80%-90%密度,約107個(gè)細(xì)胞。如有必要,可進(jìn)行刺激或處理。建議采用1×106個(gè)細(xì)胞作為一次ChIP的細(xì)胞量。

                 

                1)在20ml培養(yǎng)基中加入終濃度為1%的甲醛,輕輕渦旋培養(yǎng)皿混勻,使細(xì)胞在甲醛中固定,室溫固定10分鐘(對于轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子,可適當(dāng)延長交聯(lián)時(shí)間,但不超過30分鐘)。加入甲醛后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變;

                2)在培養(yǎng)皿中加入濃度為0.125M的甘氨酸,輕輕渦旋混勻,室溫反應(yīng)5分鐘,淬滅未反應(yīng)的甲醛,終止交聯(lián)。加入甘氨酸后培養(yǎng)基的顏色會發(fā)生改變;

                3)棄培養(yǎng)基,20ml預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞,重復(fù)洗滌一次;

                4)在培養(yǎng)皿中加入2ml 預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑混合物的1×PBS;使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞,4°C,800g,離心5分鐘;

                5)去除上清液(此步細(xì)胞可在液氮中快速冷卻,存放于-80°C保存幾個(gè)月),細(xì)胞再次重懸于0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細(xì)胞裂解緩沖液中,冰上孵育15分鐘,每5分鐘渦旋一次;

                6)4°C,800g,離心5分鐘。小心去除上清液,加入0.5ml含蛋白酶抑制劑混合物的細(xì)胞核裂解緩沖液,使其重懸。


                二、超聲處理片段化 DNA

                 

                超聲處理的效果取決于細(xì)胞類型、細(xì)胞濃度和儀器。需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定超聲的最佳條件,以便將交聯(lián)DNA剪切為如上圖的約200-1000bp長度。染色質(zhì)片段化對于ChIP實(shí)驗(yàn)成功很關(guān)鍵。片段化不足會導(dǎo)致樣本丟失,片段化過度會破壞靶標(biāo)蛋白表位、降低ChIP效率。在超聲過程中,保持樣品一直處于冰上低溫狀態(tài)。不要使探頭接觸超聲管底部或管壁,如超聲過程產(chǎn)生泡沫,需暫停超聲并調(diào)整超聲管位置。

                 

                超聲處理后,4°C,12000g離心10分鐘。離心后,留取5μl染色質(zhì)溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析,以檢測超聲效率。可將超聲前和超聲后各取的5μl染色質(zhì)溶液對比分析。


                圖1 超聲前超聲后

                 

                三、靶蛋白和DNA 免疫共沉淀

                 

                將下述緩沖液放于冰上保存:低鹽洗滌緩沖液高鹽洗滌緩沖液,LiCl洗滌緩沖液和TE洗滌緩沖液。配制450μl稀釋緩沖液(含蛋白酶抑制劑混合物),冰上保存。如有多個(gè)樣品可合并配制。

                 

                1)取上述50μl離心后的裂解液上清加入到新的離心管中,作為一次免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的DNA混合物樣本。每50μl 裂解液中含有1×106個(gè)細(xì)胞裂解產(chǎn)物。ChIP反應(yīng)包括陽性對照抗體管、陰性對照IgG管和目的蛋白抗體管。推薦陰性對照IgG和目的抗體使用同一物種來源。

                2)在上述50μl片段化染色質(zhì)樣品的離心管中加入上述配制好的450μl稀釋緩沖液,充分混勻。每管取5μl樣品于新的離心管中作為實(shí)驗(yàn)的1% “input",用于實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化與數(shù)據(jù)處理,保存于4°C,直至蛋白DNA復(fù)合物洗脫與解交聯(lián)步驟。

                3)取完inpμt的離心管中分別加入1-10μg免疫沉淀抗體,4°C轉(zhuǎn)子上孵育4h以上或過夜。

                4)每個(gè)離心管中加入20μl蛋白A/G磁珠(建議將吸頭前端剪去一小部分后再吸取磁珠),4°C轉(zhuǎn)子上孵育2h。

                5)磁力架吸附,靜置1-2分鐘,去上清。按如下步驟洗滌蛋白A/G磁珠-抗體-蛋白/DNA復(fù)合物:

                低鹽洗滌緩沖液,4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,洗滌一次;

                高鹽洗滌緩沖液,4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,洗滌一次;

                LiCl 洗滌緩沖液,4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,洗滌一次;

                 

                注:使用前將等體積A液及B液混勻,請勿提前混勻,否則會導(dǎo)致出現(xiàn)沉淀析出。TE 緩沖液,4°C轉(zhuǎn)子上孵育3-5分鐘,洗滌一次。


                圖2 靶蛋白和DNA免疫共沉淀示意圖


                四、洗脫和解交聯(lián)

                 

                實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:解凍蛋白酶K;ChIP洗脫緩沖液恢復(fù)至室溫,以確保SDS溶解;配制洗脫緩沖液;ChIP洗脫緩沖液100μl+蛋白酶K 1μl(多個(gè)樣本可合并配制)。

                1)樣品管及Input管加入ChIP洗脫緩沖液(含蛋白酶K);

                2)62°C孵育2小時(shí);

                3)在95°C下培養(yǎng)10分鐘;

                4)讓樣品冷卻至室溫;

                5)10000g離心10秒收集管蓋及管壁上殘留樣品,采用磁力架分離磁珠。將上清液小心轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的試管中。

                 

                五、DNA 純化

                采用純化柱進(jìn)行DNA純化(免疫沉淀和input)。

                 

                六、鑒定分析

                QPCR或者高通量測序的方法檢測IP得到的DNA。

                 

                七、常見問題

                 

                常見問題

                常見原因/解決辦法

                陰性對照(IgG IP)樣品的背景高

                1、優(yōu)化抗體的濃度,過量抗體導(dǎo)致非靶點(diǎn)的結(jié)合;

                2、與微珠的非特異結(jié)合:采用預(yù)純化步驟,以排除這些非靶點(diǎn),或加入微珠的封閉劑;
                3、染色質(zhì)的不充分?jǐn)嗔眩簝?yōu)化斷裂過程,以獲得長度在200-1000bp的染色質(zhì);

                4、試劑被污染;

                5、增加洗滌次數(shù)。

                DNA 回收率低

                1、ChIP 抗體失效或親和力低,使用 ChIP驗(yàn)證過的抗體;

                2、抗體使用量不足;

                3、起始樣品不足,可適當(dāng)增加起始樣品用量;

                4、過度交聯(lián)或交聯(lián)不足;
                5、磁珠與抗體的親和力低。

                無法找到合適的ChIP抗體,該如何做ChIP實(shí)驗(yàn)?

                1、使用標(biāo)簽抗體是一種解決抗體無法獲得、抗體可變性和交聯(lián)染色質(zhì)的表位被遮蔽的方法。不過標(biāo)簽有可能干擾轉(zhuǎn)錄因子的功能;

                2、嘗試IP/IHC/IF抗體,效果需要自己摸索鑒定。

                陰性對照抗體如何選擇?

                使用與ChIP抗體相同物種的正常IgG,因此如果使用小鼠單克隆抗體,建議使用正常小鼠IgG。

                 

                貨號

                品名

                規(guī)格

                abs50034

                染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試劑盒

                22T

                abs47050830

                甘氨酸

                1kg

                abs961

                10×PBS緩沖液

                500ml

                abs9118

                蛋白酶K

                100mg

                abs9330

                核糖核酸酶 A

                150ul

                 

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