類器官HE染色、免疫組化、免疫熒光鑒定方法

我們辛辛苦苦養(yǎng)好的類器官，該如何做鑒定呢？通常是HE染色、免疫組化或免疫熒光。今天小愛帶大家了解一下具體的染色步驟。

一、HE染色實驗步驟

1、類器官收集

1）類器官收集（例如24孔板，收集6-8孔類器官，大約1000-2000個類器官）

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml左右，移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。300g 4℃離心5min棄去上清。

2）類器官清洗

加入1ml PBS重懸移入1.5ml離心管，300g 4℃離心5min棄去液體。

2、類器官固定

1）PFA固定

加入1ml 4%多聚甲醛（abs9179）至EP管，輕柔吹打混勻，至于4℃固定1h（最長不超過10h）。固定結(jié)束后，300g 4℃離心5min棄去上清。

2）類器官清洗

加入1ml PBS重懸移入1.5ml離心管，300g 4℃離心5min棄去液體。

3、類器官瓊脂糖包埋

1）稱量0.2至0.4g瓊脂糖，加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi)，加入10ml左右PBS。微波爐高火融化，每隔5s暫停打開，觀察，重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化。

2）待瓊脂糖溶液降溫至50-60℃，取20-50ul融化瓊脂糖溶液，加入至1.5ml EP管重懸類器官沉淀，冰上放30min，待其凝固。

4、類器官石蠟包埋

1）脫水：取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊，在梯度乙醇中脫水，70%、80%、90%和95%乙醇各1h，100%乙醇30min，待其凝固；

2）融蠟：提前4h左右打開烘箱，65℃溶蠟；

3）透明：將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中（二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中），將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次；
注：因二甲苯有毒性，需在通風(fēng)良好區(qū)域進行操作，取出時盡量瀝盡殘留二甲苯。

4）浸蠟：透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中，60℃浸蠟2h后，更換新的蠟缸再次浸蠟2h；

5）包埋：包埋在冰盒上進行，將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處，將瓊脂塊放置于中間位置，然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M。待蠟塊凝固后，小心脫下模具。

6）切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般是5-8um厚，并用小鑷子將包含有完整組織的切片置于40°C溫水中；
7）撈組織：組織受熱展開，最好是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2，一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候最好方向一致，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。

5、類器官HE染色

1）脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 10min；二甲苯Ⅱ10min；無水乙醇Ⅰ5min；無水乙醇Ⅱ5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min；蒸餾水洗；

2）蘇木素染細(xì)胞核：切片入Harris蘇木素染3-8min，自來水洗；

3）伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色1-3min，自來水洗；

4）脫水封片：將切片依次放入95%酒精I 5min ；95%酒精II 5min；無水乙醇Ⅰ5min ；無水乙醇Ⅱ5min ；二甲苯Ⅰ5min ；二甲苯Ⅱ5min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片；

5）顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

6、類器官鑒定-HE染色結(jié)果（以肺癌為例）

人肺癌類器官HE染色

二、免疫組化實驗步驟

將HE染色步驟里脫蠟后的切片進行如下處理：

1、抗原修復(fù)：加入3%H₂O₂浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，然后倒掉H₂O₂，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來；

2、血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）；
3、加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜；
4、加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37°C溫箱中半小時；
5、加SABC：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）；
6、加顯色劑：將片子從溫箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻， 再加1滴顯色劑C，搖勻，A：DAB， B：H₂O₂，C：磷酸緩沖液）；
7、復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色半分鐘；
8、脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中；
9、封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

三、免疫熒光實驗步驟

將免疫組化步驟里一抗孵育后的切片進行如下處理：

1、加熒光二抗：PBS浸洗3次，每次3min，吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量避光操作。
2、復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標(biāo)本進行染核，用PBS清洗4次，洗去多余的DAPI；
3、封片：防熒光淬滅封片劑封片、熒光顯微鏡觀察。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎公眾號后臺留言哦！

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