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                類器官HE染色、免疫組化、免疫熒光鑒定方法

                更新時間:2023-08-14      點擊次數(shù):1738

                我們辛辛苦苦養(yǎng)好的類器官,該如何做鑒定呢?通常是HE染色、免疫組化或免疫熒光。今天小愛帶大家了解一下具體的染色步驟。

                 

                一、HE染色實驗步驟

                 

                1、類器官收集


                 

                1)類器官收集(例如24孔板,收集6-8孔類器官,大約1000-2000個類器官)

                移液器吸去培養(yǎng)基,每孔添加1-2ml左右,移液搶輕柔吹打基質(zhì)膠,收集在15ml離心管中,4℃靜置10min。300g 4℃離心5min棄去上清。

                2)類器官清洗

                加入1ml PBS重懸移入1.5ml離心管,300g 4℃離心5min棄去液體。

                 

                2、類器官固定

                 

                1)PFA固定

                加入1ml 4%多聚甲醛(abs9179)至EP管,輕柔吹打混勻,至于4℃固定1h(最長不超過10h)。固定結(jié)束后,300g 4℃離心5min棄去上清。

                2)類器官清洗

                加入1ml PBS重懸移入1.5ml離心管,300g 4℃離心5min棄去液體。

                 

                3、類器官瓊脂糖包埋

                 

                1)稱量0.2至0.4g瓊脂糖,加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi),加入10ml左右PBS。微波爐高火融化,每隔5s暫停打開,觀察,重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化。

                2)待瓊脂糖溶液降溫至50-60℃,取20-50ul融化瓊脂糖溶液,加入至1.5ml EP管重懸類器官沉淀,冰上放30min,待其凝固。

                 

                4、類器官石蠟包埋

                 

                1)脫水:取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊,在梯度乙醇中脫水,70%、80%、90%和95%乙醇各1h,100%乙醇30min,待其凝固;

                2)融蠟:提前4h左右打開烘箱,65℃溶蠟;

                3)透明:將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中(二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中),將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次;
                注:因二甲苯有毒性,需在通風(fēng)良好區(qū)域進行操作,取出時盡量瀝盡殘留二甲苯。

                4)浸蠟:透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中,60℃浸蠟2h后,更換新的蠟缸再次浸蠟2h;

                5)包埋:包埋在冰盒上進行,將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處,將瓊脂塊放置于中間位置,然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M。待蠟塊凝固后,小心脫下模具。


                 

                6)切片:將包埋好的蠟塊固定于切片機上,切成薄片,一般是5-8um厚,并用小鑷子將包含有完整組織的切片置于40°C溫水中;
                7)撈組織:組織受熱展開,最好是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時,一般取載玻片的下1/3或者下1/2,一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時候最好方向一致,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。

                 

                5、類器官HE染色

                 

                1)脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ 10min;二甲苯Ⅱ10min;無水乙醇Ⅰ5min;無水乙醇Ⅱ5min;95%酒精5min;90%酒精5min;80%酒精5min;70%酒精5min;蒸餾水洗;

                2)蘇木素染細(xì)胞核:切片入Harris蘇木素染3-8min,自來水洗;

                3)伊紅染細(xì)胞質(zhì):切片入伊紅染液中染色1-3min,自來水洗;

                4)脫水封片:將切片依次放入95%酒精I 5min ;95%酒精II 5min;無水乙醇Ⅰ5min ;無水乙醇Ⅱ5min ;二甲苯Ⅰ5min ;二甲苯Ⅱ5min中脫水透明,將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片;

                5)顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。


                 

                6、類器官鑒定-HE染色結(jié)果(以肺癌為例)


                人肺癌類器官HE染色

                 

                二、免疫組化實驗步驟

                 

                將HE染色步驟里脫蠟后的切片進行如下處理:


                1、抗原修復(fù):加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來;

                2、血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點封閉起來,然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍(900µlPBS:100µl血清封閉液);
                3、加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對照實驗,就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜;
                4、加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時;
                5、加SABC:將片子從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍(990µlPBS:10µlSABC);
                6、加顯色劑:將片子從溫箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻, 再加1滴顯色劑C,搖勻,A:DAB, B:H2O2,C:磷酸緩沖液);
                7、復(fù)染:將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色半分鐘;
                8、脫水:將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中;
                9、封片:用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。



                 

                三、免疫熒光實驗步驟

                 

                將免疫組化步驟里一抗孵育后的切片進行如下處理:

                 

                1、加熒光二抗:PBS浸洗3次,每次3min,吸干切片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中37℃孵育1h,PBS浸洗3次;注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量避光操作。
                2、復(fù)染核:滴加DAPI避光孵育5min,對標(biāo)本進行染核,用PBS清洗4次,洗去多余的DAPI;
                3、封片:防熒光淬滅封片劑封片、熒光顯微鏡觀察。

                 

                今天講解就到這了,大家如有實驗問題,歡迎公眾號后臺留言哦!


                貨號

                品名

                規(guī)格

                abs44056210

                瓊脂糖

                100g

                abs42155596

                石蠟

                500g

                abs962

                1×PBS緩沖液

                500ml/500ml*10

                abs9222

                伊紅染液

                100ml

                abs9214

                蘇木素染液

                100ml /500ml

                abs9177

                中性樹膠

                100ml/ 100ml×10

                abs7119

                1.5ml離心管(無菌無酶)

                1袋/1箱

                abs7118

                0.5ml離心管(無菌無酶)

                1袋/1箱

                abs9444

                Organotial人肝癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                abs9445

                Organotial人結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                abs9443

                Organotial人肺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                abs9449

                Organotial人胃癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                abs9447

                Organotial人胰腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                abs9589

                Organotial人鼻咽癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                abs9446

                Organotial人乳腺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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                Organotial人宮頸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒

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