【Western Blot】干貨！WB步驟及好物分享

蛋白質免疫印跡（Western blot ,WB），是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，探針是抗體，顯色用標記的二抗。

經過SDS-PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

Western blot操作繁瑣且環(huán)節(jié)眾多，實驗人員無意中犯錯的概率隨之增加，極大影響了其準確性和重復性，就操作難度而言，WB在一眾實驗中排名靠前，以下是WB步驟及好物分享。

一、試劑準備

1）10x 電泳液：Tris Base 30.3g、Glycine 144g和SDS 10g，量取800ml ddH₂0，充分攪拌溶解后，定容至1L；
2）10x 電轉液：Tris Base 30.3g、Glycine 144g，量取800ml ddH20，充分攪拌溶解后，定容至1L；
3）1x 電泳液：10x 電泳液100ml，加水定容至1L；
4）1x 電轉液：10x 電轉液100ml，甲醇200ml，最后加水定容至1L；
5）10x TBS：Tris-base 60.6g、NaCl 87.66g，量取800ml ddH₂0，充分攪拌溶解后，定容至1L；
6）1x TBST：10x TBS 100ml加水定容至1L，加入吐溫1ml；
7）10% SDS溶液：SDS 10g，在100ml ddH₂0充分溶解，放于室溫儲存?zhèn)溆茫?/span>
8）封閉液：脫脂奶粉5g，加入100ml 1x TBST溶解，配制成5%的封閉用牛奶。

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二、蛋白樣品制備

細胞總蛋白的提取

1）倒掉培養(yǎng)液，用移液槍吸干培養(yǎng)液；

2）每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS洗滌細胞，左右輕輕搖晃后棄去PBS。重復洗滌細胞三次；

3）按1ml RIPA裂解液加10ul PMSF（100mM），搖勻置于冰上；

4）每瓶細胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動；

5）裂解完后，用細胞刮片將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側，然后用移液槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中；

6）于4℃下12000rpm離心5min（提前開離心機預冷）；

7）將離心后的上清分裝至離心管中放于－20℃保存。

三、 蛋白含量的測定

制作標準曲線和檢測樣品蛋白含量

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四、SDS－PAGE電泳

制膠

按順序加溶液制備分離膠，每加完一個溶液搖晃均勻，分離膠配好后用水封住，聚合至少需要40min。然后加入濃縮膠，插入梳子，避免產生氣泡，聚合需要30min，拔梳子時盡量避免拔歪。以上是傳統(tǒng)的制膠方法，不僅耗時而且耗力，在此推薦Absin的預制膠產品，幫您節(jié)約時間。

產品特點：

1）采用自動化的灌膠生產技術，確保了產品質量的高穩(wěn)定性和重復性；
2）采用玻璃膠板，有效減少蛋白非特異性吸附，使蛋白條帶更為敏銳，清晰；
3）膠夾打開極為輕松，只需用刀片在膠夾一側輕輕劃一下即可打開；
4）凝膠中不含SDS，可用于變性和非變性電泳；
5）兼容市場上主流的mini電泳槽，如Bio-Rad, Invitrogen, 天能和君意東方等；
6）本產品電泳時間短。本預制膠推薦的電泳電壓和電泳時間為150V 40-50min，即可完成電泳并獲得非常平整和銳利的電泳條帶。

五、上樣和電泳

1）樣品準備：95℃加熱蛋白10min，快速震蕩離心，晾至室溫；
2）將膠板組裝在電泳儀器上，注意短的玻璃板朝電泳槽內放置，要對齊夾緊不能漏水；
3）將電泳液從電泳槽中開始加入，直至整個儀器全部充滿電泳液；
4）按照方案將蛋白和marker打入上樣孔中，marker 3ul即可；
5）蓋上蓋子，注意不要弄錯方向，連接電源；150V 40-50min，即可完成電泳。

六、電轉

1）PVDF膜需要在甲醇中激活；
2）電泳結束后將膠板取出，短玻璃板朝上放置，揭開短玻璃板后切除多余的膠，在水中將膠從長玻璃板上取下；
3）在電轉液中，轉膜夾黑色面朝下，依次放置石棉網-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-石棉網，夾緊轉膜夾，注意PVDF膜要與膠貼合，排走氣泡。調整轉膜夾黑色界面轉向轉膜槽負極，白色面朝向轉膜槽正極。灌滿電轉液后，用200mA恒定電流轉膜120min（具體條件自行探索）轉膜槽外周裝滿冰塊。

七、封閉

1）將膜取出后，應觀察到marker從膠轉移至膜上；
2）用TBST快速清洗掉膜上殘留的電轉液；
3）將PVDF膜浸泡在5%封閉牛奶中，緩慢搖蕩，室溫育1h。

八、抗體孵育和化學發(fā)光成像

1）封閉結束后，用1x TBST緩沖液洗掉多余的牛奶，洗膜每次5min，共3次。一抗使用一抗稀釋液或TBST按照1:5000稀釋（具體條件自行摸索）使用，然后將膜浸泡在一抗中，于4C冰箱中搖床解育過夜；
2）一抗孵育后并回收，加入1x TBST緩沖液放置于搖床上快搖5min，共3次。使用5%脫脂牛奶按照1:1000稀釋二抗，室溫慢搖1h；
3）二抗孵育完畢后，回收二抗，1x TBST快洗5min，共3次；
4）洗膜結束后，將發(fā)光液敷在膜上，通過化學發(fā)光成像儀曝光，采集并使用image J分析灰度。

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