小動物活體成像中熒光染料的選擇及應用

小動物活體成像技術（in vivo imaging technology）是利用高靈敏度的光學檢測儀器直接檢測動物活體體內的細胞活動和基因行為研究的一類技術，是近年來發展最快的生命科學研究方法，是最直接觀察細胞和分子在體內行為的新興技術，已廣泛應用于生命科學研究的各個領域[1]。

活體動物體內光學成像主要采用生物發光與熒光發光兩種技術。生物發光是利用熒光素酶報告基因在活體內表達產生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發生化學反映產生熒光。而熒光發光成像技術是將熒光物質或熒光物質標記的小分子物質如基因、細胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導入到活體體內，通過小動物活體成像系統的激發光源激發熒光集團到達高能量狀態，而后產生波長較激發光長的發射光，然后通過高靈敏度制冷CCD鏡頭探測到活體內的發射光。通過活體成像技術可以觀測活體動物體內腫瘤的生長和轉移、炎癥的發生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學過程。

本期小愛主要為大家介紹小動物活體成像實驗中常用的熒光染料及文獻研究思路！

一、D-熒光素   abs42017256

D-熒光素是螢光素酶的底物，在鎂離子存在下熒光素酶使熒光素與ATP反應，發出黃綠色的光。可與小動物活體成像系統配套使用，用于體內活體熒光檢測。

應用案例：子宮內膜癌腹膜轉移異種移植模型的研究[2]

首先構建含IL-37BΔ1-45或NC的CV146/熒光素酶慢病毒載體，感染篩選穩定表達的細胞（ISK-LV-IL37b、Δ1-45和ISK-LV-NC）。然后將穩定表達的細胞腹腔注射到小鼠體內建立子宮內膜癌腹膜轉移模型。

飼養38天后，對所有小鼠腹腔注射底物D-熒光素（abs42017256）。10分鐘后，小鼠腹腔注射0.3% Sodium Pentobarbital溶液。5分鐘后，使用體內成像系統光譜對小鼠進行體內生物發光成像（圖1）。然后處死小鼠，取出器官（肝、肺和腎）進行成像。取部分腫瘤及上述臟器用福爾馬林固定，石蠟包埋，其余冰凍于?80°C進行HE染色、免疫組化染色、免疫印跡。

圖1  IL-37b抑制子宮內膜癌腹膜轉移異種移植瘤模型的研究[2]（abs42017256 D-熒光素）

二、DiR 碘化物   abs45153692

DiR 碘化物是一種親脂性的熒光染料，經常用來染細胞膜和其它脂溶性生物結構。由于DiR的近紅外熒光可以穿透細胞和組織，因此在小動物活體成像技術中也經常使用。

應用案例：用DiR標記納米膠束，評價膠束的腫瘤靶向性以阻止缺氧腫瘤的耐藥和轉移[3]

采用薄膜分散法制備殼寡糖（COS）包被、唾液酸（SA）受體靶向的順鉑（CDDP）和一氧化氮（NO）共載體納米膠束（CTP/CDDP），并用DiR標記膠束，然后利用體內成像系統評價CTP/CDDP/DiR的腫瘤靶向性。如圖2a所示，游離DiR在注射后經歷了快速的藥物代謝和血液循環清除，在腫瘤內幾乎檢測不到其熒光信號。DiR標記的CTP/CDDP膠束給藥后3h，腫瘤組織內可見明顯的熒光，且熒光強度隨時間延長而增強。

具有智能靶向性的CTP/CDDP膠束增加了細胞對CDDP的攝取，增強了對腫瘤的細胞毒性，但降低了對正常器官或組織的全身毒性。在抗腫瘤機制方面，CTP/CDDP通過下調缺氧誘導因子-1α、谷胱甘肽2、多藥耐藥相關蛋白和基質金屬蛋白酶9的表達，減少順鉑外流，抑制腫瘤上皮間充質轉化過程，從而逆轉缺氧腫瘤細胞的耐藥和轉移。

圖2 DiR標記抗腫瘤納米膠束在小鼠體內示蹤腫瘤組織[3]（abs45153692 DiR 碘化物）

此外，用于生物標記的Cyanine 7.5（一種發近紅外熒光的花青素熒光染料）由于其熒光波長很長，發射峰（Em max）大于 800nm，恰好處于肌體組織近紅外窗口I的區域（肌體的血液，體液和組織此區域背景熒光弱，而長波長穿透性強），所以Cy7.5的標記物也常應用于小動物活體體內成像。

[1] Ntziachristos V. Going deeper than microscopy：the optical imaging frontier in biology[J]. Nature Methods，2010,7(8):603-614.

[2] Wang X, Wei Z, Tang Z, et al. IL-37bΔ1-45 suppresses the migration and invasion of endometrial cancer cells by targeting the Rac1/NF-κB/MMP2 signal pathway[J]. Laboratory Investigation [2023-06-12]. DOI:10.1038/s41374-021-00544-2.

[3] Chen Y, Fang L, Zhou W, et al. Nitric oxide-releasing micelles with intelligent targeting for enhanced anti-tumor effect of cisplatin in hypoxia.[J].Journal of Nanobiotechnology, 2021(1).DOI:10.1186/S12951-021-00989-Z.

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