多重?zé)晒饷庖呓M化Q&A（第三彈）

更新時(shí)間：2023-05-09 點(diǎn)擊次數(shù)：953

Q1：我該如何得到很好的多色結(jié)果呢？

A1：首先，您需要有質(zhì)量不錯(cuò)的樣本和抗體，這就已經(jīng)是成功的一半（樣本、抗體選擇攻略），對(duì)于樣本來說，脫片是我們需要預(yù)防的“頭號(hào)公敵"，多色實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)熱修復(fù)洗脫抗體多次，假如片子脫片，輕則成像模糊，重則組織脫落前功盡棄，可以在開始實(shí)驗(yàn)之前先模擬幾輪熱修復(fù)，不加抗體和其他試劑，看看組織是否有脫落的跡象，如果脫落比較嚴(yán)重，則需要重新制備切片，如果有輕微脫片，則可以考慮購(gòu)買抗體洗脫液（abs994），替代熱修復(fù)的過程；然后，就可以開始做實(shí)驗(yàn)了，我們建議您*行抗體和染料工作條件摸索，再上多染（參考下圖流程），這樣多染的成功率可以達(dá)到90%以上哦！（小愛經(jīng)驗(yàn)之談，即便是染了千百遍的常見指標(biāo)，換個(gè)樣本，染色效果就可能天差地別，有條件還是建議要做預(yù)實(shí)驗(yàn)。）

最后的10%，就需要調(diào)整指標(biāo)與染料搭配以及染色的順序了。

Q2：有沒有推薦的染料搭配和染色順序呢？

A2：染料搭配一般遵循“寡靶配強(qiáng)光，眾靶配弱光"的原則，意思是表達(dá)比較弱的指標(biāo)搭配熒光信號(hào)比較強(qiáng)的染料，表達(dá)相對(duì)強(qiáng)的指標(biāo)搭配信號(hào)比較弱的染料，Absin的TSA染料波長(zhǎng)越短熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，比如說需要染PD-1，CD8和CD3，我們手里有一個(gè)四色試劑盒（TSA520/TSA570/TSA650），通過IHC發(fā)現(xiàn)樣本中PD-1的信號(hào)很少，CD3信號(hào)非常多，其次是CD8，于是選擇TSA520搭配PD-1，TSA650搭配CD3，TSA570搭配CD8，比較合理。

接下來就是怎么安排染色先后順序：

1）劃分細(xì)胞定位，先外后內(nèi)：確定每個(gè)指標(biāo)的細(xì)胞定位，膜表達(dá)先染，胞漿或者胞核的后染（如果是指標(biāo)比較多的情況下，胞內(nèi)指標(biāo)排在比較后面，經(jīng)過前期多輪洗脫，可以不做細(xì)胞通透；如果指標(biāo)很少，染胞內(nèi)指標(biāo)之前還是需要打孔，多個(gè)胞內(nèi)指標(biāo)也只需要打一次孔）；
2）確定抗原修復(fù)方式，先酸后堿：堿修復(fù)比酸修復(fù)的力度會(huì)更強(qiáng)，個(gè)別抗體在用堿修復(fù)以后會(huì)染出來很多非特異性，所以如果是相同的細(xì)胞定位，就先染酸修復(fù)，再染堿修復(fù)的抗體；
3）根據(jù)IHC結(jié)果判別，先弱后強(qiáng)：組化結(jié)果顯示指標(biāo)比較少，比較弱的，排在前面染，理論上來說越靠前染的指標(biāo)效果會(huì)越接近單標(biāo)染色。

以上就是一些通用規(guī)則，但不同的指標(biāo)還是可能出現(xiàn)變化，要想得到較好的結(jié)果，就需要不同的排列組合一個(gè)一個(gè)嘗試（如下表，“X"代表有信號(hào)），這樣會(huì)比較耗費(fèi)時(shí)間和試劑，您可以根據(jù)通用規(guī)則先行一次多染，然后各通道跟熒光單染做對(duì)比，如果效果差別很大，那就再調(diào)整染色順序，如果單染的結(jié)果跟組化差別比較大（出現(xiàn)高背景，非特異性明顯），就要考慮更換染料搭配。

Target	Best Signal			Recommended Dilution
Target	1st AR	3rd AR	6th AR	Recommended Dilution
FOXP3			x	1:250
PD-1	x			1:250
LAG3		x	x	1:250
CD4		x	x	1:250

Q3：我成像完了以后想要做數(shù)據(jù)分析，你們有什么軟件推薦嗎？

A3：目前市面上數(shù)據(jù)分析軟件還是比較多的，像免費(fèi)的您可以下載imageJ、Qupath，缺點(diǎn)就是用法都需要您自行摸索；我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件，HALO是付費(fèi)的，StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺(tái)自帶的，從功能、分析的精準(zhǔn)度和可操作性來說，肯定是大大優(yōu)于開源軟件的，且有軟件專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)能夠答疑解惑。您可以根據(jù)您的實(shí)際情況選擇合適的分析軟件，如果您實(shí)在無從下手，也可以找Absin，我們可以提供數(shù)據(jù)分析的服務(wù)~

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角蛋白（CK）相關(guān)抗體	panCK、CK-4、CK HMW、CK-1、CK-10、CK-14、CK-17、CK-18、CK-19、CK-20、CK-5、CK-5&6、CK-6、CK-7、CK-8、CK-8&18
癌癥腫瘤相關(guān)	p120、p16、p21、p40、p53、p63、AFP、ALK、AMACR、ANXA1、Aurora-B、Bcl-6、CTNNB1、CA125、CDK4、CDX2、CEA、CCND1、c-MET、c-Myc、DOG1、CDH1、EGFR、EpCAM、ERG、EZH2、FABP3、FGFR2、FOXP1、GATA-3、GCDFP-15、GPC3、GZMB、HER-2、IDH1 R132H、Ki-67、LDLR、MCM7、MCM3、MGMT、MSH2、MSH6、MUC1、MUC2、MUC4、MUM1、MyoD1、Myogenin、Myosin (Smooth Muscle)、Napsin-A、N-Cadherin、Olig2、PAX-2、PAX-5、PAX-8、PCT、PD-1、PHH3、PLAP、PMEL-17、PDPN、PR、PSA、PSAP、S100A1、S100P、SALL4、SATB1、SF-1、SOX10、SOX11、SOX2、STAT6、Stathmin、TCL1、TFE3、TG、TLE1、TOP2A、TPO、TRPS1、TTF-1、Type I Cytokeratins、Type II Cytokeratins、Uroplakin III、Villin、WT1、ZAP-70
神經(jīng)相關(guān)	ATRX、p75 NGF Receptor、CgA、DDX4、GFAP、λLight Chains、MBP、NeuN、Neurofilament、NSE、Olig2、p75 NGF Receptor、S100、SYP
血管	ACE2、VEGF、VWF
鈣蛋白	CALB1、Caldesmon、Calponin、Calcitonin、Calprotectin
其他	MPO、AR、Arg-1、AR-V7、B2M、CLDN1、Collagen Type Ⅳ、COL4A5、ERα、GH、HBSAg、hCG、hCG-beta、hPL、IgD、IgG、IgM、IGFBP3、Insulin、Oct3/4、SCGN、Somatostatin、TDT、Actin、Desmin

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