多重?zé)晒饷庖呓M化Q&A（第二彈）

Q1：為什么每染一個抗體就要做抗原修復(fù)呢，我可以只在第一個指標(biāo)做，后面不做嗎？

A1：不可以的，每染完一個抗體都是需要做抗原修復(fù)的。染第一個抗體之前做抗原修復(fù)，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識別到抗原；在染后面每一個抗體之前的抗原修復(fù)，目的是為了去除掉上一輪染色的抗體和殘留沒有結(jié)合上的染料，其實更準(zhǔn)確的叫法是“抗體洗脫"，因為我們做多色實驗，沒有限制一抗的來源，您的一抗可能都是來源于兔子，那我們對應(yīng)每一個一抗所使用的二抗都是抗兔，如果不洗脫前一個一抗，染第二個抗體的時候，二抗也會和上一輪的一抗結(jié)合，產(chǎn)生大面積非特異性染色，所以抗體洗脫是整個多色實驗不能缺少的核心步驟。

Q2：抗原修復(fù)液（抗體洗脫液）每一輪修復(fù)都要更換嗎？

A2：需要的，首先我們的抗原修復(fù)液需要根據(jù)下一輪要染的一抗來選擇，有的一抗需要用檸檬酸修復(fù)，有的又需要EDTA修復(fù)，抗體廠家往往會注明他們的抗體需要用什么修復(fù)液；其次，就算我們所有的一抗都是推薦用檸檬酸修復(fù)，但每洗脫完一個指標(biāo)，修復(fù)液中都會殘留上一個指標(biāo)的抗體，如果重復(fù)使用修復(fù)液，會對后面的指標(biāo)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致非特異性染色。

Q3：我的組織有自發(fā)熒光，我還能做多色嗎？

A3：一般情況下是可以的。首先，您可以用熒光成像設(shè)備直接觀察您白片（不做任何處理的組織切片）的自發(fā)熒光情況，可以每一個通道都成像試試，看看自發(fā)熒光具體是在哪個或者哪些通道能夠觀察到；確定了自發(fā)熒光大概的波長范圍以后，我們在選擇多色染料的時候，要避開自發(fā)熒光所在的波長，比如您的自發(fā)熒光在FITC通道能夠觀察到，在其他通道都沒有，那對應(yīng)Absin多色染料有重合的就是TSA520，在染多色的時候只要不選TSA520即可。當(dāng)然我們?yōu)榱吮荛_自發(fā)熒光通道，勢必要舍棄一些染料，那最后能染的顏色數(shù)量也會相應(yīng)減少，并且假如您發(fā)現(xiàn)樣本在您儀器的所有熒光通道都能觀察到信號，那這個樣本就不適合用來做多色了，需要重新制備樣本。

Q4：微波修復(fù)，高壓修復(fù)，抗體洗脫液洗脫，這幾種修復(fù)方式做出來的染色效果差別大嗎？

A4：修復(fù)方式對染色效果的影響其實視一抗和樣本來定。對于大部分的石蠟樣本，我們推薦用高壓熱修復(fù)，這種修復(fù)方式是大家一直認(rèn)為比較好的修復(fù)方式，Absin實驗室一直采用的也是高壓熱修復(fù)，當(dāng)然微波熱修復(fù)效果也不錯，但不同微波爐的性能不同，所以工作條件不能復(fù)刻，需要做一些摸索，并且微波熱修復(fù)可能會持續(xù)比較長的時間，容易導(dǎo)致修復(fù)液蒸干影響效果。而抗體洗脫液主要是針對一些無法采用熱修復(fù)或者熱修復(fù)容易脫片的樣本（如冰凍切片、硬骨切片等），工作條件更溫和，洗脫效果則取決于切片厚度、洗脫溫度和時間、一抗種類（洗脫難度：結(jié)構(gòu)性膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白 > 胞漿蛋白 > 胞核蛋白）。對于能夠經(jīng)得起多輪熱修復(fù)的樣本，我們更推薦采用熱修復(fù)。

Q5：做多色實驗，除了多色試劑盒以外，我還需要準(zhǔn)備什么材料呢？

A5：我們試劑盒里面包含TSA熒光染料、染料稀釋液、二抗、DAPI、抗熒光淬滅封片劑，除了這些以外的試劑都是需要您自己準(zhǔn)備的，按照免疫組化的試劑準(zhǔn)備即可。最重要的是您需要配備熒光成像設(shè)備。

Q6：我們實驗室有熒光設(shè)備，但我不知道能否用來觀察多色？

A6：您需要確認(rèn)您的熒光設(shè)備各個通道的激發(fā)波長和發(fā)射波長（可以咨詢儀器廠家），跟我們熒光染料的波長做匹配（見下表），我們提供的是最佳波長，在該波長下能夠得到很好的成像效果，但假如參數(shù)相差30nm，也是可以觀察到的；如果您確實無從得知具體的儀器參數(shù)，那也可以做一些近似波長匹配，比如您知道您的顯微鏡可以觀察FITC，那么對應(yīng)Absin多色染料近似是TSA520；如果您發(fā)現(xiàn)您儀器的個別通道也不在我們近似波長的清單中，比如Texas Red，那您可以查一些資料確認(rèn)一下該染料的激發(fā)波長和發(fā)射波長（Texas Red EX/EM：570/600nm），再去對應(yīng)Absin的染料參數(shù)，跟TSA620（EX/EM：590/620nm）比較近，激發(fā)和發(fā)射波長都在30nm范圍內(nèi)，那么判斷該通道是可以觀察TSA620這個染料的。但染料近似匹配還是有可能存在觀察不了的情況，確認(rèn)儀器參數(shù)是很精準(zhǔn)的，如果最后發(fā)現(xiàn)染完色確實成像不了，也可以咨詢Absin掃片服務(wù)哦。

表1 Absin多色熒光染料波長對照表

表3 Absin多重?zé)晒饷庖呓M化全套解決方案