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                類器官與PBMC共培養實驗方案,超實用!不信還學不會

                更新時間:2023-02-20      點擊次數:1633

                最近很多寶寶問類器官如何跟PBMC共培養這個實驗的關鍵點還是要先養好類器官,可以參照之前的類器官原代培養篇 “ 類器官原代培養全流程 "。




                圖1 基質膠法構建類器官

                那類器官培養成功的標準是什么呢首先是我們培養的類器官需要穩定傳代3代以上,才能表示其干性是比較好的,其次就是要經過組化鑒定,觀察其和原組織形態和細胞類型上是否保持一致。經過鑒定后就可以進入我們下一步的實驗了,類器官組化的方法跟我們常規組織操作方法是十分類似的,區別就在于類器官的固定上,操作方法小愛也給大家整理好了。詳見“類器官實操大本營之——固定包埋"

                .

                圖2 類器官組化鑒定


                現在就進入我們共培養環節啦!

                1、類器官準備

                1)提前一周,復蘇培養類器官至狀態良好;

                2)取合適數量類器官,使用預冷PBS清洗數次,去除大部分基質膠;

                3)使用培養基重懸類器官。

                2、PBMC分離和類器官共培養

                1)外周血在無菌環境下,使用添加EDTA-K2的真空采血管采集,運輸保存;

                2)酒精消毒采血管表面,在生物安全柜內打開,將外周血轉入無菌15mL離心管;

                3)使用Ficoll法分離PBMC;

                4)PBMC計數,計算活力與與細胞數;

                5)使用培養基(RPMI1640,10%FBS,1%雙抗,2mM谷氨酰胺,5ng/mL  IL-4與GM-CSF),懸浮調整至合適濃度,96孔板,每孔約加入5*105 活PBMC,100uL體積;

                6)重懸類器官混合液,分別加入等量的樣至96孔板中,至總體積200uL。

                3、培養觀察

                1)D0觀察記錄細胞狀態;

                2)37℃,5%CO2條件下培養,每日連續觀察;

                3)D3吸出100uL培養上清,加入100uL新培養基,同時加入(處理抗體或藥物)使至終濃度100nM(如果D3已出現顯著差別,則記錄大視野明場形態,終止實驗);

                4)觀察至實驗組間差異顯著,拍照記錄大視野細胞明場形態;

                5)細胞上清保存用于后續檢測。



                此圖為我司做得免疫共培養實驗,從上圖可明顯看出B藥物作用下,T細胞有明顯的殺傷效果。


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