CHIR99021的實驗參考方法介紹

　　CHIR99021（CHIR99021，CHIR 99021）是氨基嘧啶衍生物，是一種高效的GSK-3α（IC50：10 nm）和GSK-3β（IC50：6.7 nm）抑制劑，CHIR-99021對GSK-3的選擇性比接近的同源物CDC2、ERK2以及其他蛋白激酶高500倍以上。CHIR-99021激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導胚胎干細胞的心肌向分化。

　　CHIR99021的實驗參考方法介紹：

　　一、激酶測定

　　通過使用其His或Glu標簽從SF9細胞中純化激酶。純化Glu標記的蛋白質，純化His標記的蛋白質。激酶測定在96孔板中用適當的肽底物在300μL反應緩沖液中進行（50mM Tris-HCl，pH 7.5,10mM MgCl 2,1mM EGTA，1mM二硫蘇糖醇，25mMβ-甘油磷酸鹽，1mM的變化）NaF和0.01％牛血清白蛋白）。肽的Km值為1至100μM。將CHIR 99021或CHIR GSKIA加入3.5μLMe2SO中，然后加入ATP至終濃度為1μM。溫育后，將三份100μL等分試樣轉移至含有100μL/孔50μMATP和20mM EDTA的Combiplate 8平板。1小時后，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗孔5次，填充200μL閃爍液，密封，30分鐘后在閃爍計數器中計數。所有步驟均為室溫。抑制百分比計算為100×（抑制劑-無酶對照）/（Me2SO對照-無酶對照）。

　　MCE尚未獨立確認這些方法的準確性。它們僅供參考。

　　二、細胞分析

　　使用MTT測定法在暴露于不同濃度的GSK3抑制劑三天后測定小鼠ES細胞的存活力。MTT活性的降低是一種可靠的基于代謝的測試，用于量化細胞活力;這種減少與細胞活力的喪失相關。將2,000個細胞在含有LIF的ES細胞培養基中的明膠包被的96孔板上接種過夜。第二天，將培養基更換為不含LIF且血清濃度降低的培養基，并補充0.1-1μMBIO，或1-10μMSB-216763，CHIR-99021或CHIR-98014。不含GSK3抑制劑或DMSO的基礎培養基用作對照。所有測試條件一式三份進行分析