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                基質(zhì)膠(OrganoGel)用于類器官3D體外培養(yǎng)操作手冊(cè)

                更新時(shí)間:2022-08-02      點(diǎn)擊次數(shù):3024



                產(chǎn)品背景



                基底膜是動(dòng)物體內(nèi)上皮細(xì)胞基底面的一層基質(zhì)膜。OrganoGel 是從小鼠腫瘤組織提取的基底膜成分, 所形成的基質(zhì)膠。該基質(zhì)膠主要成分為 laminin,collagen IV,heparan sulfate proteoglycans(Kleinman et al. 1986)。同時(shí),該基質(zhì)膠也包含多種生長因子,例如表皮生長因子 EFG,血小板衍生生長因子 PDGF, 神經(jīng)生長因子 NGF,堿性成纖維細(xì)胞生長因子 FGF-2,乙型轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-beta 和胰島素樣生長因子 ILGF (Vukicevic et al.1992)。

                OrganoGel 實(shí)際應(yīng)用案例


                圖 1.人膽管類器官在 A 公司的基質(zhì)膠和 OrganoGel 基質(zhì)膠中的生長情況。人膽管類器官由細(xì)胞核染料 DAPI(藍(lán)色),緊密 連接蛋白抗體 anti-ZO1 和細(xì)胞骨架蛋白 F-actin 的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin 染色成像。

                圖2. 人原發(fā)腸癌類器官在A公司的基質(zhì)膠和OrganoGel基質(zhì)膠中的生長情況。

                圖3. 肝癌類器官在A公司的基質(zhì)膠和OrganoGel基質(zhì)膠中的生長情況。肝癌類器官由細(xì)胞核染料DAPI(藍(lán)色),肝臟細(xì)胞生物標(biāo)志物HNF4a和肝癌標(biāo)志物GPC3的抗體染色成像。

                圖4. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC 在 A 公司的基質(zhì)膠和 OrganoGel 基質(zhì)膠上均可形成血管網(wǎng)絡(luò)。HUVEC細(xì)胞由活細(xì)胞染料Calcein AM染色(綠色)成像。

                 

                操作方法


                一、 類器官培養(yǎng)(操作所需時(shí)間為 1 小時(shí))

                1. 將基質(zhì)膠于 4°C 冰箱里的冰上過夜解凍。

                2. 將 24 孔板放置于培養(yǎng)箱預(yù)熱。

                3. 用預(yù)冷的槍頭將解凍的基質(zhì)膠進(jìn)行分裝。

                4. 準(zhǔn)備病人或者動(dòng)物組織(或者類器官)來源的,細(xì)胞總數(shù)為 1X105的單細(xì)胞懸液。300g 離心 5min。

                5. 取 50µL 的 OrganoGel 基質(zhì)膠與離心所得的細(xì)胞進(jìn)行混勻。

                6. 取出預(yù)熱的 24 孔板,立即將基質(zhì)膠與細(xì)胞的混合物滴加在孔板里,立即將 24 孔板放入培養(yǎng)箱。

                7. 約 10min 后,基質(zhì)膠凝固后,向孔板里加入 500µL 類器官培養(yǎng)基,放于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

                 

                二、腫瘤類器官藥敏實(shí)驗(yàn)(操作所需時(shí)間為 2 小時(shí))

                1. 將擴(kuò)增好足夠量的腫瘤類器官(實(shí)驗(yàn)組)以及正常類器官(對(duì)照組)用 4°C 預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重懸,緩慢機(jī)械吹打,促進(jìn)膠液化溶解,并保持類器官結(jié)構(gòu)完整(可用于懸浮培養(yǎng)于有 5%基質(zhì)膠溶液的基質(zhì)膠表面)(Guillen et al. 2022)。或者通過 TryplE 酶消化獲得單細(xì)胞懸液。

                2. 離心收集類器官細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

                3. 加入 OrganoGel 基質(zhì)膠原液,與細(xì)胞進(jìn)行混勻。

                4. 將細(xì)胞與膠的混合物,通過排槍加入 37°C 預(yù)熱過的 96 孔板,或者 384 孔板,立即將孔板放入培養(yǎng)箱。

                5. 大約 10min 后,OrganoGel 基質(zhì)膠將凝固,加入相應(yīng)體積的類器官培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

                6. 類器官形成后(如果是機(jī)械吹打,類器官將在傳代 24h 后就會(huì)形成;如果是酶消化,類器官會(huì)在 3-5 天 后形成),每個(gè)孔分別加入含有 PI 染料以及不同種類、不同濃度的待篩選的抗腫瘤藥物。

                7. 用高內(nèi)涵顯微鏡上進(jìn)行活細(xì)胞成像,測(cè)定腫瘤類器官對(duì)各種藥物的敏感性。

                 

                三、免疫缺陷小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)(操作所需時(shí)間為 1 小時(shí))

                1. 搜集用于注射小鼠的細(xì)胞 1X105個(gè),以 1:1 的體積與 OrganoGel 基質(zhì)膠混合,為方便注射,建議每次注射總體積不低于 100µL。

                2. 用脫毛器對(duì)小鼠注射部位皮膚進(jìn)行脫毛,然后用酒精棉球進(jìn)行消毒。

                3. 用不帶針頭的 1mL 注射器將細(xì)胞和膠的混合物吸入針頭,再裝上 16g 的針頭(針頭內(nèi)直徑為 1.194mm), 將混合物注射到皮下,或者大腿肌肉(針對(duì)代謝特別旺盛的腫瘤細(xì)胞)。

                 

                四、血管生成實(shí)驗(yàn)(以永生化 HUVEC 細(xì)胞系為例,操作所需時(shí)間為 1 小時(shí))

                1. 將*培養(yǎng)基換成饑餓細(xì)胞用培養(yǎng)基:加入含 0.2% FBS,2mM L-谷氨酰胺,1mM 丙酮酸鈉,100U/ml 青 霉素和 100µg/ml 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 小時(shí)。

                2. 將 OrganoGel 基質(zhì)膠均勻鋪滿 96 孔板底。注意:槍頭需提前預(yù)冷半小時(shí)。盡量在冰上操作,避免基質(zhì)膠過早固化,避免氣泡產(chǎn)生。

                3. 將 96 孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 30min,固化基質(zhì)膠。

                4. 消化 HUVEC 細(xì)胞,并計(jì)數(shù)。

                5. 將 200µL 的 HUVEC 細(xì)胞懸液(含 5X104個(gè)細(xì)胞)加于含基質(zhì)膠的 96 孔板中。將 96 孔板放于培養(yǎng)箱。

                6. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將于 3 至 12 小時(shí)間形成。

                7. 在血管網(wǎng)絡(luò)形成最佳時(shí)間,小心去除培養(yǎng)基,并用加入含活細(xì)胞染料 1/1000 Calcein AM(綠色)的培養(yǎng) 基進(jìn)行染色,并用顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

                 

                五、神經(jīng)軸突 3D 生長實(shí)驗(yàn)(以大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞為例,操作所需時(shí)間為 2 小時(shí))

                1. 取孕期 12-15 天的大鼠胚胎,用眼科剪和眼科鑷分離出大腦皮層于 4°C 預(yù)冷的 DMEM 培養(yǎng)基中。

                2. 用吸管輕緩吹打,然后用 70µm 濾網(wǎng)過來,獲得單細(xì)胞懸液,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

                3. 離心(300g,3min),棄上清。將細(xì)胞與 OrganoGel 基質(zhì)膠進(jìn)行混合,然后將基質(zhì)膠混合物滴加在 24 孔 板中,每孔 50µl。

                4. 將 24 孔板放于培養(yǎng)箱,大約 10min 后,OrganoGel 基質(zhì)膠將凝固。加入 1mL 神經(jīng)元分化培養(yǎng)基:Neurobasal medium,2% B27, 2mM L-glutamine,5%FBS,20ng/mL EGF 和 20ng/mLbFGF,100U/mL penicillin 和 100 µg/mL streptomycin。第二天開始,就能觀察到有明顯的神經(jīng)軸突生長。

                5. 在第 7 天可觀察到大量的神經(jīng)突(Neurite)長出。

                 

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                操作

                abs9490

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                參考文獻(xiàn):

                1.Kleinman HK, et al, Basement membrane complexes with biological activity Biochemistry 25: 312 (1986).

                2.Vukicevic , Slobodan, et al. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental cell research 202: 1 (1992).

                3.Guillen, K P, et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology . Nature Cancer 3: 232 (2022).


                Absin特色產(chǎn)品線(全部現(xiàn)貨):
                WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動(dòng)劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

                 

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