DNA純化——PCR產(chǎn)物純化

一、產(chǎn)物直接純化

PCR擴(kuò)增完成后需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在條帶單一無(wú)其他雜帶的情況下，可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，常見(jiàn)的純化方法有：

1、硅膠層析柱法

原理：大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜，實(shí)際上就是一層玻璃纖維，其表面有大量修飾的硅羥基（Si-OH），硅羥基在溶液中解離后帶負(fù)電，然后與帶正電鹽離子、帶負(fù)電DNA形成電橋，從而吸附住DNA，使得DNA雙鏈變單鏈，不會(huì)被生物大分子溶劑洗脫，但能經(jīng)水溶性緩沖液水化后，被定量回收，從而實(shí)現(xiàn)純化分離。

圖1 硅膠層析原理示意圖

 圖2 硅膠層析流程簡(jiǎn)圖

2、磁珠法（abs60151）

原理：磁珠是有磁性的能吸附DNA的物質(zhì)，其內(nèi)部核心是鐵離子，在磁場(chǎng)作用下可以吸附在磁體上。在核心外，經(jīng)過(guò)羧化，帶有羧基基團(tuán)，在特定的離子條件下，可以與DNA結(jié)合。結(jié)合后，在外磁場(chǎng)的作用下，磁珠與DNA結(jié)合體移動(dòng)到磁體周?chē)梢院芊奖闳コ渌嘤嗟囊后w，這時(shí)，不能與磁珠結(jié)合的所有雜質(zhì)都隨水溶液一并去除。然后，在洗脫條件下，DNA與磁珠分離，溶解在水中，將溶解有DNA的溶液轉(zhuǎn)移，就得到了純化后的DNA樣本。

圖3 磁珠法結(jié)構(gòu)示意圖

 圖4 磁珠法純化DNA流程簡(jiǎn)圖

3、其他純化方法

①滲透液結(jié)合醇沉純化

原理：利用分子大小不同，小分子的物質(zhì)能夠通過(guò)滲透膜溶解到大量的溶液中去，而大分子的物質(zhì)不能通過(guò)滲透膜，所以繼續(xù)留存在透析袋中，通過(guò)乙醇沉淀最后達(dá)到去除小分子物質(zhì)，得到純化的有機(jī)大分子的效果。

②直接沉淀純化

原理：DNA分子在高鹽離子醇溶液中會(huì)被沉淀出來(lái)，而其他物質(zhì)繼續(xù)溶液在溶液中，沉淀出來(lái)的DNA分子經(jīng)過(guò)離心與溶液成分分開(kāi)，達(dá)到純化的目的。
 

不同純化方法對(duì)比

二、凝膠回收純化

如電泳檢測(cè)結(jié)果存在非特異性條帶，則需要將目的條帶切出來(lái)，再用膠回收試劑盒（abs60098）對(duì)凝膠進(jìn)行回收純化，相較于直接純化，只是多了一步溶膠的過(guò)程，相應(yīng)的產(chǎn)物純度提高，回收率則下降。

結(jié)語(yǔ)：

在PCR擴(kuò)增完成后，反應(yīng)體系中除了DNA段，還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)影響后續(xù)克隆測(cè)序等實(shí)驗(yàn)，因此對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化是必*步驟，不同的純化手段各有自己的優(yōu)缺點(diǎn)，老師們可以根據(jù)自己的需求選擇適合自己的方法。

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