ELISA檢測(cè)中的OD值知多少？

“OD值”這個(gè)概念想必做實(shí)驗(yàn)的各位小伙伴們都不陌生，從判斷提取核酸的質(zhì)量及濃度，到BCA蛋白定量進(jìn)行蛋白定量，又或者是ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白含量，這些常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)都需要檢測(cè)樣品的“OD值”，但是，“OD值”到底是個(gè)什么東西，我們?cè)跍y(cè)量“OD值”的時(shí)候又有哪些需要注意的問題，今天就讓小編給小伙伴們好好說道說道。
 

什么是“OD”值？

OD全稱optical density，也就是光密度，也可以稱為吸光度。吸光度指的是利用物質(zhì)*的吸收光譜，來鑒別物質(zhì)或者測(cè)定物質(zhì)的含量，也就是將一束特定波長(zhǎng)的光通過被檢測(cè)物，被檢測(cè)物可以將光吸收掉一部分，通過吸光度計(jì)算被檢測(cè)物的濃度。一般被檢測(cè)物濃度越高，吸光度的值就會(huì)越高。實(shí)驗(yàn)中也是利用“OD值”和被檢測(cè)物的濃度之間的關(guān)系來根據(jù)吸光度。

了解了“OD值”是什么之后，接下來我們?cè)倏纯丛诓煌膶?shí)驗(yàn)中測(cè)量“OD值”有哪些需要注意的。

需要注意的就是測(cè)量時(shí)的光波長(zhǎng)。上文在介紹“OD值”概念時(shí)提到，吸光度利用的是物質(zhì)*的吸收光譜，實(shí)際操作中我們需要注意的關(guān)鍵的也是這一點(diǎn)，不同物質(zhì)的吸收光譜不同，大吸收峰的波長(zhǎng)也不同，為了達(dá)到好的測(cè)量效果，一般來講，我們需要在待測(cè)物質(zhì)的大吸收波長(zhǎng)處來檢測(cè)其“OD值”。例如，核酸在260nm波長(zhǎng)處光吸收大，而蛋白和酚類物質(zhì)則在280nm波長(zhǎng)處光吸收大；BCA法檢測(cè)蛋白含量時(shí)，顯色反應(yīng)后，溶液由淺綠色變?yōu)樽仙藭r(shí)在560nm處有大光吸收值；TMB法顯色的ELISA實(shí)驗(yàn)，在加入終止液后溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色，在450nm處有大光吸收。
 

除了吸收波長(zhǎng)，一些實(shí)驗(yàn)還需要設(shè)置校正波長(zhǎng)，校正波長(zhǎng)往往遠(yuǎn)離大吸收波長(zhǎng)，作為本底吸收，排除由于氣泡、灰塵等其他系統(tǒng)誤差造成的“OD值”偏差。根據(jù)測(cè)得的“OD值”，進(jìn)行雙波長(zhǎng)校正，可以有效的減少系統(tǒng)誤差造成的影響。

對(duì)于測(cè)量得到的待測(cè)樣本“OD值”還需要進(jìn)行換算才可以得到終的濃度，有很多小伙伴往往在這一步出現(xiàn)錯(cuò)誤，功虧一簣。需要注意的地方也比較簡(jiǎn)單，就是根據(jù)對(duì)應(yīng)試劑盒的說明書，采用推薦的曲線擬合方式進(jìn)行擬合，擬合后需要看一下擬合曲線的R2值，約接近1證明曲線擬合度越高，結(jié)果越可信。如果R2值較低，則需要檢查是否出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋問題或?qū)嶒?yàn)操作出現(xiàn)失誤。拿愛必信的試劑盒來舉例，BCA 蛋白定量試劑盒（abs9232），此款試劑盒推薦的標(biāo)曲擬合方式就是直線擬合，而ELISA試劑盒系列產(chǎn)品，則推薦用四參數(shù)擬合方式進(jìn)行標(biāo)曲擬合。選擇錯(cuò)誤的擬合方式，會(huì)影響曲線擬合度，R2值較低，回歸計(jì)算的待測(cè)樣品濃度也不準(zhǔn)確。溫馨提示：BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)以及ELISA實(shí)驗(yàn)的顯色過程都是受反應(yīng)時(shí)間及溫度等條件影響的，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況及時(shí)終止實(shí)驗(yàn)進(jìn)行讀數(shù)，做實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量不要走開哦~
 

關(guān)于“OD值”本期就先分享到這，看到后的小伙伴們還有福利，小編在這里把一款小巧的曲線擬合軟件ELISA Calc分享給大家，常見的曲線擬合方式都在里面，幫助大家測(cè)好“OD值”，得到好結(jié)果。

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