組化筆的實驗原理與意義

    自制組化筆在免疫組化染色中的應(yīng)用戴曉淳，組化筆在免疫組化染色中，為防止抗體外溢和被稀釋，必須擦掉切片組織周邊的液體，耗時費力。采用Ｓ—Ｐ法免疫組化染色的切片經(jīng)二甲苯脫蠟、純酒精脫苯后，用自制組化筆在切片組織周圍畫一圓圈，再逐級水化，以后染色步驟按試劑盒說明進行。目前，國外生產(chǎn)的組化筆，價格貴，國內(nèi)尚未生產(chǎn)。用自制的組化筆經(jīng)標(biāo)記后，每步只需甩掉液體后直接滴加抗體進行染色，此時滴加的抗體被限定在組化筆所劃好的范圍內(nèi)，無外流現(xiàn)象。本法每張切片平均滴加抗體２０～３０ｍｌ，明顯節(jié)省了抗體，染色結(jié)果與擦片法比較也無明顯差別，此油性圈在組化染色完成后，經(jīng)酒精逐級脫水、二甲苯透明后即可去除。將液體灌入廢棄的ＭＡＲＫＥＲ筆或水彩筆，即成組化筆。

    細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶，用封閉通透液浸潤切片30min（RT 避光）配法是用預(yù)熱 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加熱幾分鐘后，臨用前加 400 ul 30％H 2 O 2 。PBS 溶液洗 3 次×3 min。抗原修復(fù)暴露抗原決定族 10) 切片放入 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4min至沸騰后，再加熱約 6 min×4 次， 每次間隔補足液體， 防止干片。封閉非特異性蛋白 11) PBS 溶液洗 3 次×3 min； 12) 將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈, 在圓圈內(nèi)組織滴入 5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中，室溫30（10～30）min。一抗孵育 13) 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入 已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫 1 小時，然后4度過夜，從冰箱中取出需 37 ℃復(fù)溫 45 min。二抗孵育。將一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次。用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30min（回收）。