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                實(shí)驗(yàn)室WB常見(jiàn)問(wèn)題指南之樣品常見(jiàn)問(wèn)題

                更新時(shí)間:2018-04-24      點(diǎn)擊次數(shù):4650

                針對(duì)樣品的常見(jiàn)問(wèn)題:

                Q:細(xì)胞水平要做Western Blot,多少細(xì)胞提的蛋白夠Western Blot?

                A:一般地5* 106就足夠了。

                Q: 同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白嗎,這樣對(duì)Western Blot有無(wú)影響? 

                A:能,沒(méi)有問(wèn)題的。

                Q: 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎?

                A:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。

                Q: 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?

                A: 如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑就要溫和得多,這時(shí)建議加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

                Q: 蛋白變性后可以存放多久?

                A:-80℃,一兩年沒(méi)有問(wèn)題。zui關(guān)鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

                Q: 如果上樣量超載,要用什么方法來(lái)增加上樣量?如果需要加大上樣量使原來(lái)弱的條帶能看清楚。

                A:可以濃縮樣品,也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30%是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm厚度的凝膠。

                Q: 接下來(lái)我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù),二抗是生物素化的多克隆抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后,封閉液是否要作調(diào)整,能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成,是嗎? 

                A:不能使用脫脂奶粉,因?yàn)槊撝谭壑泻锼兀肂SA代替應(yīng)該好一點(diǎn),此外如果用于磷酸化指標(biāo)蛋白的檢測(cè)時(shí)也不能用脫脂奶粉,因?yàn)槊撝谭壑泻欣业鞍住?/span>

                Q:一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎?

                A:Western Blot一般上樣30-100微克不等,結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系,也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開始摸條件時(shí),為了拿到陽(yáng)性結(jié)果,各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復(fù)地試了,當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。

                Q: 做組織樣品的western的時(shí)候,處理樣品有什么訣竅嗎?還有,您用過(guò)大牛血清做封閉劑嗎?濃度如何?效果是不是比BSA好一點(diǎn)?

                A:組織樣品必須進(jìn)行研磨、勻漿超聲處理,蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好,離心要充分,膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),需要注意抑制蛋白酶的活性(加入PMSF和蛋白酶抑制劑 cocktail),封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體,使用BSA也是不錯(cuò)的選擇。

                Q: 大分子量蛋白200 kD,在做western要注意什么呢?

                A:做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意,分離膠建議選擇>7%的;剝膠時(shí)要小心;轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng);要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析)。

                Q:蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求?

                A:上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等, 如果只是要定性,則沒(méi)有太大的關(guān)系, 盡量多上就行了, 但是不要超過(guò)0.3μg/mm2


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