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| 問題一：轉膜不充分 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 膜沒有*均勻濕透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10kDa | 選擇小孔徑的膜，縮短轉移時間 |
| 靶蛋白等電點等于或接近轉移緩沖液PH值 | 可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH10.5）或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液 |
| 甲醇濃度過高 | 過高甲醇濃度濃度會導致蛋白質與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 |
| 轉移時間不夠 | 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉移時間 |
| 問題二：背景高 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 膜沒有*均勻濕透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數 |
| 封閉不充分 | 增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等） |
| 二抗濃度過高 | 降低二抗濃度 |
| 檢測過程中膜干燥 | 保證充分的反應液，避免出現干膜現象 |
| 曝光過度 | 縮短曝光時間 |
| 抗體與封閉蛋白有交叉反應 | 檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應 |
| 二抗的非特異性背景 | 增加一個二抗對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否有二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重連的） |
| 問題三：無信號 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 酶失活 | 直接將酶和底物進行混合你，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內。有活性的酶聯物 |
| 標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照，如果陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加樣本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 |
| 試劑之間不匹配 | 一抗與標本種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性 |
| 一抗失效 | 選擇有效期內抗體；并選擇現配現用的工作液 |
| HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有* |
| 問題四：弱信號 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決辦法 |
| 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
| 酶活性降低 | 直接將酶和底物進行混合，如果顯色弱則說明酶活性降低了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物 |
| 標本中靶蛋白含量太低 | 增加標本上樣量 |
| 洗膜過度 | 縮短洗滌時間和次數 |
| 抗體活性降低 | 選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置 |
| 蛋白轉移不充分 | 見上述 |
| 封閉過度 | 較少封閉劑的量或縮短時間；更換不同封閉劑類型 |
| 曝光時間過短 | 延長曝光時間 |
| HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉 |
| 問題五：非特異性條帶（多條帶） | |
| 可能的原因 | 驗證或解決辦法 |
| 二抗的非特異性結合 | 增加一個二抗對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
| 一抗的特異性不夠 | 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 |
| 蛋白降解 | 使用新鮮制備的抗體，并使用蛋白酶抑制劑 |
| 抗體濃度過高 | 降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶 |
| 不同剪切體存在 | 有些來源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法，每個剪切方式得到的蛋白大小都是不同的 |
| 細胞傳代過多導致蛋白變異 | 使用原代或傳代少的細胞作對照 |
| 蛋白上樣量過大 | 降低上樣量 |
| 問題六：條帶大小不對 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決辦法 |
| 二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質變性過程及強度 |
| 翻譯后剪切 | 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執行功能是需要進行剪切成活化的形式，如procaspases |
| 相對電荷 | 氨基酸的組成（charged vs non-charged） |
| 蛋白修飾 | 比如氨基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加 |
| 問題七：背景有黑色斑點 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 封閉試劑中有聚集體 | 使用前過濾封閉試劑 |
| 抗體和封閉試劑反應 | 使用前過濾封閉試劑 |
| HRP偶聯二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 |
| 問題八：背景有不均勻的白色斑點 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 轉膜過程中有氣泡產生 | 仔細檢查，避免存在氣泡 |
| 抗體分布不均勻 | 孵育抗體時使用搖床 |
| 問題九：膜出現反像（白色帶） | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方式 |
| HRP含量過高 | 降低酶聯二抗的濃度 |
| 問題十：微小條帶 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 電泳速度過快 | 減少電壓等減慢電泳速度 |
| 電泳溫度過高 | 在冷室或者冰浴中進行電泳，改變電泳PH值 |
| 問題十一：Marker變黑色 | |
| 可能的原因 | 驗證或解決方法 |
| 抗體和Marker蛋白反應 | 在Maeker和sample之間空出一個孔不上樣 |
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