抗體相關(guān)問題FAQ

1.如何保存和分裝抗體？

      對于許多抗體而言，分裝為小等份在 -20℃ 或 -80℃下凍存是*的保存條件。抗體保存應(yīng)避免反復(fù)凍融，分裝可以zui大限度減少凍融對抗體造成的損壞，還可避免多次從同一管中移取抗體而引入污染。但是每份不應(yīng)該少于10 uL。分裝的體積越小，抗體的濃度受蒸發(fā)和管壁吸附的影響就會越大。大部分情況下，抗體在 4 ℃條件下能夠保存1-2周。但有部分特例。為了防止微生物污染，可在抗體中加入適當(dāng)濃度的NaN₃。如果要用抗體對活細(xì)胞進(jìn)行染色或處理，或者要用抗體進(jìn)行體內(nèi)研究，則不能使用含NaN₃的抗體制備物；這種抗菌劑對大部分生物體都有毒害作用。部分加甘油的抗體，直接儲存在-20℃即可。

2.如何正確選擇一抗？

      根據(jù)檢測的種屬和實(shí)驗方法尋找相關(guān)一抗產(chǎn)品，樣品的性質(zhì)決定哪個抗體zui合適。需考慮以下方面：

      (1) 檢測的蛋白質(zhì)區(qū)域。有些抗體僅能識別已還原和變性的蛋白質(zhì)，因為這樣露出了蛋白折疊形成的二級和三級結(jié)構(gòu)中隱藏起來的表位。而有些抗體僅能識別天然、折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)上的表位。免疫組化中，有些抗體僅適用于未固定的冷凍組織，如果沒有抗原修復(fù)步驟逆轉(zhuǎn)福爾馬林固定所引起的交聯(lián)，那么其它抗體不能與福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中的靶標(biāo)結(jié)合。

      (2) 樣品處理方式；有些抗體要求樣品用特定方式處理。

      (3) 產(chǎn)生一抗的生物體應(yīng)與樣品生物體不同；這是為了避免抗免疫球蛋白的二抗與樣品中的內(nèi)源性免疫球蛋白間發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.如何正確選擇二抗？

      二抗是指專門和一抗進(jìn)行特異性反應(yīng)和結(jié)合的抗體，在免疫學(xué)反應(yīng)中，經(jīng)常需要針對試驗選擇不同的二抗?？紤]以下方面：

      (1) 針對一抗來源的二抗；比如一抗是小鼠來源的，二抗就要是抗小鼠的。

      (2) 二抗需與一抗的類別或亞類相匹配；比如一抗是IgM，二抗就要是抗IgM的抗體。

      (3) 為了增加特異性、降低背景：可以選擇Fab段的抗體（去除Fc段的）、經(jīng)過標(biāo)本來源種屬血清吸附的的二抗。

      (4) 查看二抗的說明書，選擇經(jīng)過驗證可以用于相應(yīng)實(shí)驗方法的二抗。

      (5) 可以通過一抗說明書頁面的“Related Products”來選擇合適的二抗。

4.二抗耦聯(lián)標(biāo)記

      標(biāo)記物與抗體偶聯(lián)，以顯示目標(biāo)蛋白的存在。標(biāo)記物的選擇取決于實(shí)驗應(yīng)用。主要有：

         (1) 熒光標(biāo)記；熒光標(biāo)記物在特定波長的光激發(fā)下發(fā)出可見范圍內(nèi)的光。有多種熒光標(biāo)記物可供選擇，它們具有*的激發(fā)和發(fā)射特性。

         (2) 酶標(biāo)記；酶標(biāo)記物如辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 在與適當(dāng)?shù)牡孜锘旌蠒r形成有色沉淀。

         (3) 生物素標(biāo)記；生物素化的抗體可用于放大信號，具體通過親和素-生物素-酶或熒光染料復(fù)合物或者親和素或鏈霉親和素偶聯(lián)到酶或熒光染料實(shí)現(xiàn)。

5. 如何確定抗體的稀釋比例?

      如果說明書中有推薦的稀釋比例，請按照該稀釋比例進(jìn)行實(shí)驗。但是由于標(biāo)本類型、實(shí)驗條件、操作環(huán)境等各種因素的影響，推薦濃度僅作為參考。實(shí)驗者需要在推薦濃度周圍進(jìn)行多個濃度梯度的實(shí)驗，從中發(fā)現(xiàn)*的稀釋比例。如果說明書沒有推薦稀釋比例，僅注明“Use at an assay dependent dilution”，就需要做大量的預(yù)實(shí)驗來摸索*的稀釋比例。