二抗簡介與選擇

   第二抗體是指能和抗體結(jié)合，即抗體的抗體，其主要作用是檢測抗體的存在，放大一抗的信號(hào)。二抗是利用抗體是大分子的蛋白質(zhì)具有抗原性的性質(zhì)，去免疫異種動(dòng)物，由異種動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的針對(duì)于此抗體的免疫球蛋白。二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體（如IgG、IgM或IgA等）均具有反應(yīng)性。

二抗與一抗的區(qū)別？  

   *抗體就是平常所說的抗體，即能和抗原特異性結(jié)合。第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測抗體的存在。一抗是針對(duì)抗原的抗體，二抗是針對(duì)一抗的抗體。即抗體也可以充當(dāng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。也就是說，抗原進(jìn)入機(jī)體刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由B細(xì)胞可以產(chǎn)生與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特殊蛋白質(zhì)。一抗二抗都是一種可以特異結(jié)合別的物質(zhì)的基團(tuán)，而且一抗可以至少結(jié)合兩種其他基團(tuán)（底物和二抗）。

為什么標(biāo)記二抗檢測以及二抗的作用？

    一抗可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。二抗可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測一抗。如果一抗自己帶有可以被檢測出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），則不需要二抗。但這樣成本很高，因?yàn)橐环N一抗只識(shí)別一種底物，這樣成本高，工作量大。所以如今的設(shè)計(jì)一般是二抗帶上可檢測標(biāo)記，再來檢測一抗，而一抗識(shí)別底物。這樣，當(dāng)一抗結(jié)合到底物上，就可以通過二抗檢測出來。

二抗的設(shè)計(jì)原理

   根據(jù)同一種來源的同種亞型抗體的Fc段是保守的，根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)出二抗，二抗與一抗的來源Fc段亞型相關(guān)。

如何選擇正確的二抗？

   1.針對(duì)一抗的宿主來源選擇：二抗指向一抗的物種

   2.針對(duì)一抗的類別亞型的選擇： 二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。

   3.二抗的種屬來源：除雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)以外，一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒有太多的差別。

   4.二抗的耦聯(lián)標(biāo)記：針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)方法選擇不同的標(biāo)記，一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，熒光基團(tuán)(FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等)、生物素、金顆粒。一般做WB、 ELISA、 IHC等實(shí)驗(yàn)都是推薦HRP標(biāo)記的二抗，做IF FC等都是FITC標(biāo)記的抗體。

   5.預(yù)吸附二抗的選擇：對(duì)于于富含免疫球蛋白的組織和細(xì)胞，通常推薦使用預(yù)吸附血清的二抗于蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用。預(yù)吸附的二抗與內(nèi)源免疫球蛋白發(fā)生相互作用的可能性較低，因此可降低非特異性背景

   6.特殊要求： F(ab’)2片段形式的二抗可避免與Protein A /G或與Fc受體的結(jié)合，其分子本身比較小，更容易滲透入細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)內(nèi)而靈敏度更高 。Fab片段形式的二抗是只含有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白；一般無要求的都是指抗IgG H&L，它是zui常用也是的二抗形式，這類抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，也可以和其他的免疫球蛋白家族（IgM，IgA，IgD,IgE）和亞家族反應(yīng)，因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥加邢嗤妮p鏈.